申请日2017.05.23
公开(公告)日2017.08.04
IPC分类号C08B37/00; C07D311/30; C07D311/40; C07J1/00; C07C67/48; C07C69/732
摘要
本发明公开了一种从红薯废水中提取制备非淀粉多糖、小分子营养分子的方法。具体的，采用过滤、洗脱、生物酶解等多种方式，成功制备得到较高纯度的非淀粉多糖及黄酮、去氢表雄酮、绿原酸小分子营养成分产品。本发明利用生产红薯淀粉排弃的红薯废水中提取制备红薯非淀粉多糖及小分子营养物质，使得红薯废水这一废弃物得到高效转化利用，减少了环境污染，提高了经济效益;本发明所属方法耗能低、效率高、提取率高、环境友好，工业化生产前景和市场前景广阔。
权利要求书
1.一种从红薯废水中提取制备非淀粉多糖及小分子营养分子的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将红薯废水离心分离，得红薯上清液体;
(2)将步骤(1)中得到的红薯上清液体使用孔径为0.45nm的滤膜过滤;
(3)将步骤(2)中的滤过液调pH为碱性，上样大孔树脂进行富集，径高比1:3～1:5，上样量为10BV～50BV，流速10～20BV/h，采用体积浓度为60%的乙醇溶液洗脱，乙醇溶液的用量为1BV～3BV;对洗脱液抽滤干燥得黄酮、去氢表雄酮、绿原酸小分子营养成分粗品。
(4)将步骤(2)中的残留液调pH为碱性，向残留液中加入1.0～4.0%(蛋白总量)复合蛋白酶酶解处理;
(5)酶解处理完成后，向残留液中加入氯仿-正丁醇(体积比为5:1)进行萃取，从而使蛋白沉淀，得非淀粉多糖溶液;
(6)对非淀粉多糖溶液进行脱色处理后抽滤干燥即得非淀粉多糖粗品。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中离心处理条件为：转速为1000～3000rpm，时间为1～5min。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中pH调节为8～9，大孔树脂为非极性或中极性大孔树脂。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述大孔树脂为X-5大孔树脂。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中pH调节为8～9。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中复合蛋白酶为Alcalase碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的混合物。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，酶处理具体条件为：处理温度为40～50℃，转速为100～120rpm，处理时间为2～4h。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述Alcalase碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的酶活均为50000U/g，三者的质量比为1-3:3:0.5，优选为1:3:0.5。
9.如权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(6)中脱色处理的具体步骤为：依次采用双氧水和乙醇进行脱色，使得非淀粉多糖溶液中的双氧水和乙醇质量分数分别为10%和20%。
10.权利要求1-9任一项所述方法制备得到的黄酮、去氢表雄酮、绿原酸小分子营养成分产品和红薯非淀粉多糖产品。
说明书
一种从红薯废水中提取制备非淀粉多糖及小分子营养分子的方法
技术领域
本发明属于废水回收利用领域，具体涉及一种从红薯废水中提取制备非淀粉多糖及小分子营养分子的方法。
背景技术
红薯是我国四大主要粮食之一，是世界卫生组织公布的最健康的食品之一。从红薯中制备红薯淀粉是目前最为常见的红薯深加工方式，其传统生产的工艺流程如下：原料选择-水洗-破碎-磨碎过滤-兑浆-撇缸和坐缸-撇浆-起粉-干燥。其中，在撇缸过程中的上层泔水直接作为红薯废水排放，不仅造成环境水质污染，也是对红薯中有效成分的浪费。据统计，一个年产仅1000吨红薯淀粉的企业，每年排弃的红薯废水就超过2万吨。
由于红薯废水中含有淀粉、蛋白、多糖等多种营养成分，现有技术中已经报道从红薯废水中提取制备红薯粘液蛋白，然而，根据文献报道，红薯废水中还含有丰富的碳水化合物和黄酮、去氢表雄酮、绿原酸等多种小分子营养分子，其中，红薯非淀粉多糖是一种淡棕色、略带糖和红薯香气的粉末状固体，其是由还原糖、戊糖、糖醛酸或糖蛋白组成的混合多糖，分子量在30～40kD左右，具有较高的生理活性，如清除自由基、抗氧化、降血糖、降血脂、提高免疫力等作用。而黄酮、去氢表雄酮、绿原酸等小分子营养分子也已报道具有抗氧化、消炎杀菌、抗癌等多种有益作用。因此亟需提供一种从红薯废水提取非淀粉多糖及黄酮、去氢表雄酮、绿原酸等小分子营养成分的方法，从而既能解决环境污染问题，同时亦能提高红薯淀粉产品附加值，然而迄今为止，尚未有相关文献报道。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供一种从红薯废水中提取制备非淀粉多糖及小分子营养分子的方法。该方法耗能低、效率高、提取率高、环境友好，工业化生产前景和市场前景广阔。
具体的，本发明的技术方案如下：
一种从红薯废水中提取制备非淀粉多糖及小分子营养分子的方法，包括如下步骤：
(1)将红薯废水离心分离，得红薯上清液体;沉淀为淀粉返回红薯淀粉制备工艺中继续使用;
(2)将步骤(1)中得到的红薯上清液体使用孔径为0.45nm的滤膜过滤;其中，滤过液中主要含有黄酮、去氢表雄酮、绿原酸等小分子营养成分和无机离子，残留液中主要包含蛋白质、非淀粉多糖;
(3)将滤过液调pH为碱性，上样大孔树脂进行富集，径高比1:3～1:5，上样量为10BV～50BV，流速10～20BV/h，采用体积浓度为60%的乙醇溶液洗脱，乙醇溶液的用量为1BV～3BV，得到含有黄酮、去氢表雄酮、绿原酸等小分子营养成分的乙醇洗脱液;将乙醇洗脱液除去乙醇，抽滤干燥得黄酮、去氢表雄酮、绿原酸等小分子营养成分粗品;
(4)残留液调pH为碱性，向残留液中加入1.0～4.0%(蛋白总量)复合蛋白酶酶解处理;
(5)酶解处理后，向残留液中加入氯仿-正丁醇(体积比为5:1)进行萃取，从而使蛋白沉淀，得非淀粉多糖溶液;
(6)对非淀粉多糖溶液进行脱色处理后抽滤干燥即得非淀粉多糖粗品。
优选的，所述步骤(1)中离心处理条件为：转速为1000～3000rpm，时间为1～5min;
所述步骤(2)中滤膜孔径为0.45nm;经试验验证，采用上述孔径能最大程度将小分子营养成分和多糖蛋白质分离;
优选的，所述步骤(3)中pH调节为8～9，大孔树脂为非极性或中极性大孔树脂，进一步优选为X-5大孔树脂;
优选的，所述步骤(4)中pH调节为8～9，所述复合蛋白酶为Alcalase碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的混合物，进一步优选的，所述Alcalase碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的酶活均为50000U/g，三者的质量比为1-3:3:0.5(优选为1:3:0.5);所述酶处理具体条件为：处理温度为40～50℃，转速为100～120rpm，处理时间为2～4h;
优选的，所述步骤(6)中脱色处理的具体步骤为：依次采用双氧水和乙醇进行脱色，使得非淀粉多糖溶液中的双氧水和乙醇质量分数分别为10%和20%。
本发明还公开了上述提取制备方法制备得到的黄酮、去氢表雄酮、绿原酸小分子营养成分产品和红薯非淀粉多糖产品。
本发明原理：由于红薯废水中非淀粉多糖、黄酮、去氢表雄酮、绿原酸小分子等营养成分的含量偏低，而其中黄酮、去氢表雄酮、绿原酸等分子量较小(<1kD)，与蛋白质、多糖等分子量差异显著，因此直接选用滤膜将黄酮、去氢表雄酮、绿原酸等小分子营养物质与多糖、蛋白质分开，在分离的同时，对蛋白质与非淀粉多糖又起到浓缩作用，从而节约人力及物资资源;同时，滤过液中尽管含有黄酮、去氢表雄酮、绿原酸，但是同时还含有丰富的无机离子，因此选用特定的大孔树脂并通过参数调整，从而成功将三者富集，分离富集效果好，同时大孔树脂可重复使用，进一步降低制备成本;
由于残留液中还含有较丰富的蛋白质，同时，红薯非淀粉多糖中部分非淀粉多糖与蛋白质通过糖苷健结合在一起，因此为得到较纯净的非淀粉多糖，需将蛋白质与非淀粉多糖进行分离，常用Sevage法(氯仿-正丁醇5：1)去除多糖中的蛋白质，该方法条件温和，但是效率极低，必须重复多次(有文献报道需重复20～30次)才能去除尽可能多的蛋白质，同时，反复提取液也导致多糖样品损失，从而导致得率降低，因此该法其工业应用价值较低，申请人意外发现，在Sevage法中之前先行采用特定复合蛋白酶酶解，能够有效将红薯中蛋白质进行酶解，而后仅需使用Sevage法1-2次即可实现蛋白脱除率最大化，同时由于使用Sevage法去除次数极大降低，也极大减少了多糖损失量，最大程度的保留了红薯非淀粉多糖。
同时，由于红薯废水中的显色物质复杂，主要包含酚类色素以及还原糖与氨基酸反应所生成的高相对分子质量的褐色聚合物，发明人通过不断摸索，最终确定采用双氧水氧化脱色及乙醇醇沉脱色方式，既能有效去除红薯废水中的显色物质，同时以避免单一使用高浓度双氧水氧化脱色造成的非淀粉多糖酯化度的破坏，从而进一步影响纯化后的非淀粉多糖活性、色泽等指标。
本发明的有益效果：本发明利用生产红薯淀粉排弃的红薯废水中提取制备红薯非淀粉多糖及小分子营养物质，使得红薯废水这一废弃物得到高效转化利用，减少了环境污染，提高了经济效益;本发明所属方法耗能低、效率高、提取率高、环境友好，工业化生产前景和市场前景广阔。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，由于红薯废水中含有丰富的碳水化合物和黄酮、去氢表雄酮、绿原酸等多种小分子营养分子，而现有技术中并没有相关文献报道。
有鉴于此，本发明的一种典型的实施方式中，提供一种从红薯废水中提取制备非淀粉多糖及小分子营养分子的方法，包括如下步骤：
(1)将红薯废水离心分离，得红薯上清液体;沉淀为淀粉返回红薯淀粉制备工艺中继续使用;
(2)将步骤(1)中得到的红薯上清液体使用孔径为0.45nm的滤膜过滤;其中，滤过液中主要含有黄酮、去氢表雄酮、绿原酸等小分子营养成分和无机离子，残留液中主要包含蛋白质、非淀粉多糖;
(3)将滤过液调pH为碱性，上样大孔树脂进行富集，径高比1:3～1:5，上样量为10BV～50BV，流速10～20BV/h，采用体积浓度为60%的乙醇溶液洗脱，乙醇溶液的用量为1BV～3BV，得到含有黄酮、去氢表雄酮、绿原酸等小分子营养成分的乙醇洗脱液;将乙醇洗脱液除去乙醇，抽滤干燥得黄酮、去氢表雄酮、绿原酸等小分子营养成分粗品;
(4)残留液调pH为碱性，向残留液中加入1.0～4.0%(蛋白总量)复合蛋白酶酶解处理;
(5)酶解处理后，向残留液中加入氯仿-正丁醇(体积比为5:1)进行萃取，从而使蛋白沉淀，得非淀粉多糖溶液;
(6)对非淀粉多糖溶液进行脱色处理后抽滤干燥即得非淀粉多糖粗品。
本发明的又一典型实施方式中，步骤(1)中离心处理条件为：转速为1000～3000rpm，时间为1～5min;
步骤(2)中滤膜孔径为0.45nm;经试验验证，采用上述孔径能最大程度将小分子营养成分和多糖蛋白质分离;
本发明的又一典型实施方式中，步骤(3)中pH调节为8～9，大孔树脂为非极性或中极性大孔树脂，进一步优选为X-5大孔树脂;
本发明的又一典型实施方式中，步骤(4)中pH调节为8～9，所述复合蛋白酶为Alcalase碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的混合物，进一步优选的，所述Alcalase碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的酶活均为50000U/g，三者的质量比为1-3:3:0.5(优选为1:3:0.5);所述酶处理具体条件为：处理温度为40～50℃，转速为100～120rpm，处理时间为2～4h;
本发明的又一典型实施方式中，步骤(6)中脱色处理的具体步骤为：依次采用双氧水和乙醇进行脱色，使得非淀粉多糖溶液中的双氧水和乙醇质量分数分别为10%和20%。
本发明的又一典型实施方式中，提供了上述提取制备方法制备得到的黄酮、去氢表雄酮、绿原酸小分子营养成分产品和红薯非淀粉多糖产品。
为了进一步对本发明进行解释说明，提供如下实施例和对比例。
实施例1
一种从红薯废水中提取制备非淀粉多糖及小分子营养分子的方法，包括如下步骤：
(1)将红薯废水经离心机离心分离(转速为2000rpm，时间为3min)，得红薯上清液体;沉淀为淀粉返回红薯淀粉制备工艺中继续使用;
(2)将步骤(1)中得到的红薯上清液体使用孔径为0.45nm的滤膜过滤;其中，滤过液中主要含有黄酮、去氢表雄酮、绿原酸等小分子营养成分和无机离子，残留液中主要包含蛋白质、非淀粉多糖;
(3)将滤过液调pH为8，上样X-5大孔树脂进行富集，径高比1:5，上样量为20BV，流速10BV/h，采用体积浓度为60%的乙醇溶液洗脱，乙醇溶液的用量为2BV，得到含有黄酮、去氢表雄酮、绿原酸等小分子营养成分的乙醇洗脱液;将乙醇洗脱液除去乙醇，抽滤干燥得黄酮、去氢表雄酮、绿原酸等小分子营养成分粗品;
(4)残留液调pH为9，向残留液中加入2.0%(蛋白总量)复合蛋白酶酶解处理;所述复合蛋白酶为Alcalase碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的混合物，所述Alcalase碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的酶活均为50000U/g，三者的质量比为1:3:0.5;所述酶处理具体条件为：处理温度为45℃，转速为100rpm，处理时间为3h;
(5)酶解处理后，向残留液中加入氯仿-正丁醇(体积比为5:1)进行萃取2次，从而使蛋白沉淀，得非淀粉多糖溶液;
(6)对非淀粉多糖溶液进行脱色处理后抽滤干燥即得非淀粉多糖粗品，脱色处理的具体步骤为：依次采用双氧水和乙醇进行脱色，使得非淀粉多糖溶液中的双氧水和乙醇质量分数分别为10%和20%。
实施例2
一种从红薯废水中提取制备非淀粉多糖及小分子营养分子的方法，包括如下步骤：
(1)将红薯废水经离心机离心分离(转速为1000rpm，时间为5min)，得红薯上清液体;沉淀为淀粉返回红薯淀粉制备工艺中继续使用;
(2)将步骤(1)中得到的红薯上清液体使用孔径为0.45nm的滤膜过滤;其中，滤过液中主要含有黄酮、去氢表雄酮、绿原酸等小分子营养成分和无机离子，残留液中主要包含蛋白质、非淀粉多糖;
(3)将滤过液调pH为8，上样X-5大孔树脂进行富集，径高比1:3，上样量为30BV，流速20BV/h，采用体积浓度为60%的乙醇溶液洗脱，乙醇溶液的用量为1BV，得到含有黄酮、去氢表雄酮、绿原酸等小分子营养成分的乙醇洗脱液;将乙醇洗脱液除去乙醇，抽滤干燥得黄酮、去氢表雄酮、绿原酸等小分子营养成分粗品;
(4)残留液调pH为9，向残留液中加入3.0%(蛋白总量)复合蛋白酶酶解处理;所述复合蛋白酶为Alcalase碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的混合物，所述Alcalase碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的酶活均为50000U/g，三者的质量比为2:3:0.5;所述酶处理具体条件为：处理温度为40℃，转速为100rpm，处理时间为3h;
(5)酶解处理后，向残留液中加入氯仿-正丁醇(体积比为5:1)进行萃取2次，从而使蛋白沉淀，得非淀粉多糖溶液;
(6)对非淀粉多糖溶液进行脱色处理后抽滤干燥即得非淀粉多糖粗品，脱色处理的具体步骤为：依次采用双氧水和乙醇进行脱色，使得非淀粉多糖溶液中的双氧水和乙醇质量分数分别为10%和20%。
实施例3
一种从红薯废水中提取制备非淀粉多糖及小分子营养分子的方法，包括如下步骤：
(1)将红薯废水经离心机离心分离(转速为2000rpm，时间为5min)，得红薯上清液体;沉淀为淀粉返回红薯淀粉制备工艺中继续使用;
(2)将步骤(1)中得到的红薯上清液体使用孔径为0.45nm的滤膜过滤;其中，滤过液中主要含有黄酮、去氢表雄酮、绿原酸等小分子营养成分和无机离子，残留液中主要包含蛋白质、非淀粉多糖;
(3)将滤过液调pH为8，上样X-5大孔树脂进行富集，径高比1:5，上样量为10BV，流速20BV/h，采用体积浓度为60%的乙醇溶液洗脱，乙醇溶液的用量为3BV，得到含有黄酮、去氢表雄酮、绿原酸等小分子营养成分的乙醇洗脱液;将乙醇洗脱液除去乙醇，抽滤干燥得黄酮、去氢表雄酮、绿原酸等小分子营养成分粗品;
(4)残留液调pH为8，向残留液中加入4.0%(蛋白总量)复合蛋白酶酶解处理;所述复合蛋白酶为Alcalase碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的混合物，所述Alcalase碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的酶活均为50000U/g，三者的质量比为1:3:0.5;所述酶处理具体条件为：处理温度为45℃，转速为120rpm，处理时间为1h;
(5)酶解处理后，向残留液中加入氯仿-正丁醇(体积比为5:1)进行萃取3次，从而使蛋白沉淀，得非淀粉多糖溶液;
(6)对非淀粉多糖溶液进行脱色处理后抽滤干燥即得非淀粉多糖粗品，脱色处理的具体步骤为：依次采用双氧水和乙醇进行脱色，使得非淀粉多糖溶液中的双氧水和乙醇质量分数分别为10%和20%。
对比例1
方法同实施例1，区别在于使用大孔树脂HPD-100替换X-5。
对比例2
方法同实施例1，区别在于使用大孔树脂D-101替换X-5。
对比例3
方法同实施例1，区别在于使用大孔树脂HPD-826替换X-5。
测定经吸附后的滤过液中剩余柴黄酮、去氢表雄酮、绿原酸小分子营养成分的总浓度，计算实施例1和对比例1-3的吸附率，结果见表1。
测定洗脱液中黄酮、去氢表雄酮、绿原酸小分子营养成分的总浓度，计算实施例1和对比例1-3的解吸率，结果见表1。
表1
同时，计算实施例1和对比例1-3四种大孔树脂对黄酮、去氢表雄酮、绿原酸的吸附量，结果见表2。
表2
由表1和表2可以看出，X-5型号大孔树脂吸附及解吸附效果远优于其他吸附树脂。
对比例4
方法同实施例1，区别在于上样流速调整为5BV/h。
对比例5
方法同实施例1，区别在于上样流速调整为20BV/h。
对比例6
方法同实施例1，区别在于上样流速调整为30BV/h。
对比例7
方法同实施例1，区别在于上样流速调整为40BV/h。
上样完成后，测定实施例1、对比例4-6中大孔树脂对黄酮、去氢表雄酮、绿原酸小分子营养成分的总吸附率，结果见表3;
表3
结果表明，上样流速较低时，大孔树脂对黄酮、去氢表雄酮、绿原酸的吸附率较高，随着流速的增加，大孔树脂对黄酮、去氢表雄酮、绿原酸的吸附率降低。但上样流速也不宜偏低，流速过低会降低生产效率，增加生产成本。因此，综合考虑吸附效果和生产效率，以实施例1所采用的上样流速10BV/h为宜。
对比例8
方法同实施例1，区别在于将大孔树脂的径高比调整为1:2。
对比例9
方法同实施例1，区别在于将大孔树脂的径高比调整为1:6。
对比例10
方法同实施例1，区别在于将大孔树脂的径高比调整为1:9。
测定实施例1、对比例8-10大孔树脂对黄酮、去氢表雄酮、绿原酸小分子营养成分的总吸附率和解吸率，结果见表4;
表4
结果表明，当树脂径高比为1：9时，吸附量和解吸率最好。但结合工业生产实际，以实施例1所采用的树脂径高比1：5为最佳条件。
对比例11
方法同实施例1，区别在于不使用复合蛋白酶。
对比例12
方法同实施例1，区别在于复合蛋白酶为木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，二者质量比为1:1。
对比例13
方法同实施例1，区别在于复合蛋白酶为Alcalase碱性蛋白酶和胰蛋白酶，二者质量比为1:1。
对比例14
方法同实施例1，区别在于复合蛋白酶为Alcalase碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶，二者质量比为1:1。
对比例15
方法同实施例1，区别在于仅使用过氧化氢进行氧化脱色。
对实施例1及对比例11-15得到的红薯非淀粉多糖相关指标进行测定，具体测定指标为，采用紫外扫描分光光度仪，在200～300nm进行扫描，结果显示，仅有实施例1制备得到的多糖溶液在260nm和280nm处无吸收峰，表明实施例1不含核酸和蛋白质等杂质成分;
以制备得到的红薯非淀粉多糖清除羟基自由基能力为指标，对实施例1及对比例11-15得到的非淀粉多糖进行测定，结果如表5所示。
表5
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
