申请日2015.06.19
公开(公告)日2015.09.16
IPC分类号C12N15/10
摘要
同时提取污水生物处理水样中微生物胞内和胞外DNA的方法，属于污水处理技术领域。先预处理;再分离胞内和胞外DNA，然后分别提取纯化胞内DNA和胞外DNA。可以从活性污泥法等生物处理污水样品中同时提取胞内和胞外DNA并进行准确定量，收率高，纯度高，并且菌体裂解的交叉污染小，简单易行，非常适合对含大量微生物的污水样品进行对比实验和科学研究使用，也具有开发加工成商业分析试剂盒的应用前景。
权利要求书
1.同时提取污水生物处理水样中微生物胞内和胞外DNA的方法，其特征在于，包括以下 步骤：
1)预处理
取污水样品10mL，加入NaH2PO4溶液和聚乙烯基吡咯烷酮，常温条件下放置摇床震荡混 匀，得预处理样品;
2)分离胞内和胞外DNA
(1)将步骤1)预处理所得样品进行离心，得到沉淀物A和上清液A;
(2)将步骤(1)所得沉淀物A重悬于NaH2PO4溶液中，得重悬液A;
(3)将步骤(1)所得上清液A用无菌滤膜过滤，收集滤液放冰盒内保藏，含截留物的 滤膜重悬于NaH2PO4溶液中震荡，滤膜洗脱截留物后弃除，得重悬液B;
(4)合并重悬液A和重悬液B，再重复步骤(1)～(3)，得到重悬液C，另将冰盒内 保藏的样品合并得总滤液;
(5)将重悬液C和总滤液分别进行离心，分别得到沉淀物B1和沉淀物B2，以及上清液 B1和上清液B2;将沉淀物B1和沉淀物B2合并，得沉淀物C，沉淀物C用于提取胞内DNA， 将上清液B1和上清液B2合并，得上清液C，上清液C用于提取胞外DNA;
3)提取纯化胞内DNA
(1)将沉淀物C加入DNA提取缓冲液和玻璃珠,涡旋震荡，然后加入SDS缓冲液，得 混合液;
(2)将步骤(1)得到的混合液采用冻融法破胞，即将混合液交替进行液氮浴和水浴， 然后进行离心，离心后所得上清液D置于冰盒内保藏，离心后所得沉淀物D重悬于DNA提取 缓冲液中，得重悬液D;
(3)将重悬液D进行涡旋震荡后水浴，再加入SDS缓冲液，然后水浴，接着离心，将 离心后所得上清液E置于冰盒内保藏;
(4)对上清液E采用商用试剂盒纯化DNA，得到胞内DNA;
4)提取纯化胞外DNA
将步骤2)中的步骤(5)所得上清液C加入CTAB后水浴，接着离心，离心后转移上清 液，然后利用商用试剂盒纯化其中DNA，得到胞外DNA。
2.如权利要求1所述同时提取污水生物处理水样中微生物胞内和胞外DNA的方法，其特 征在于，在步骤1)中，所述NaH2PO4溶液为0.12M，pH 8.0;NaH2PO4溶液加入量9～11mL; 所述聚乙烯基吡咯烷酮加入量为0.5g～1.5g。
3.如权利要求1所述同时提取污水生物处理水样中微生物胞内和胞外DNA的方法，其特 征在于，在步骤2)中，所述NaH2PO4溶液为0.12M，pH 8.0;所述无菌滤膜的孔径为≥0.22 μm;所述重复步骤(1)～(3)的次数为1～5次;所述离心的条件为：离心温度4℃，离 心力≥10000g，离心时间10～20min。
4.如权利要求1所述同时提取污水生物处理水样中微生物胞内和胞外DNA的方法，其特 征在于，在步骤3)中，其中步骤(1)使用的DNA提取缓冲液成分包括100mM Tris-HCl、 100mM Na2-EDTA、100mM Na3PO4、1.5M NaCl、1%CTAB以及0.001～0.1mg/mL蛋白酶K; DNA提取缓冲液的加入量是3～5mL;所述玻璃珠的直径为1mm，玻璃珠加入量是0.5～1g; 所述SDS缓冲液为浓度10%SDS缓冲液，10%SDS缓冲液加入量为1～3mL。
5.如权利要求1所述同时提取污水生物处理水样中微生物胞内和胞外DNA的方法，其特 征在于，在步骤3)中，其中步骤(2)所述将混合液交替进行液氮浴和水浴的次数为1～5 次;所述液氮浴的时间为1min，水浴的温度为60℃，水浴的时间为20min;所述离心的条 件为：离心温度4℃，离心力≥13000g，离心时间≥20min。
6.如权利要求1所述同时提取污水生物处理水样中微生物胞内和胞外DNA的方法，其特 征在于，在步骤3)中，其中步骤(3)所述涡旋震荡的转速为2500rpm，时间为5min，水 浴的温度为37℃，水浴的时间为2h;所述SDS缓冲液为浓度10%SDS缓冲液，10%SDS缓 冲液加入量是1～3mL。
7.如权利要求1所述同时提取污水生物处理水样中微生物胞内和胞外DNA的方法，其特 征在于，在步骤4)中，所述CTAB的质量百分浓度为1%，1%CTAB的加入量与上清液C的体 积比为1∶1;水浴的温度为65℃，水浴的时间为30min;所述离心的条件为：离心温度4 ℃，离心力≥13000g，离心时间≥20min。
说明书
同时提取污水生物处理水样中微生物胞内和胞外DNA的方法
技术领域
本发明属于污水处理技术领域，涉及微生物胞内和胞外DNA的提取方法，尤其是涉及一 种同时提取污水生物处理水样中微生物胞内和胞外DNA的方法。
背景技术
通过微生物降解可溶性和悬浮性有机污染物是目前污水处理厂的核心工艺，最有代表性 的即活性污泥法。只要为微生物提供适宜的生长环境，微生物充分生长，就可以最大限度的 去除有机污染物，提高出水水质。换言之，微生物的数量和类别直接决定了污水生物处理的 效果。而污水中微生物群落结构复杂，传统的微生物纯种培养方法费时费力且效果不佳，故 目前关于环境微生物的研究大都采用以DNA为基础的分子生物学技术研究。同时，尽管胞外 DNA在水体中数量极低且容易分解,一些胞外DNA也被发现对于环境微生物群体和污水处理效 果有重要作用。当前胞外DNA对环境的影响越来越受到重视，但是胞外DNA提取工艺的研究 很少，特别针对污水生物处理水样同时提取其中胞内胞外DNA的方法更是未见报道。
现有活性污泥DNA提取的方法中，一般是通过简单的污水水样预处理(如离心、过滤) 等收获微生物泥渣，然后采用溶菌酶、珠磨、冻融等手段破胞释放胞内DNA，再进一步提取 纯化(王爱杰，张运晴，阚洪静，刘充.一种厌氧活性污泥DNA的提取方法[P].中国，2009: CN101392248A;赵晓祥，张湾，邓航.一种SBR中活性污泥样品DNA的提取方法[P].中国， 2013:CN103215254A)，这时甚至可以使用一些市售的DNA提取试剂盒。这样的污泥DNA提取 流程，并没有特别考虑胞外基因问题，胞外DNA被当作杂质在预处理过程中被清除，或者仅 提取样品总DNA不区分来源于胞内或胞外。因此，若要同时提取污水水样中的胞内和胞外DNA， 面临很多困难，首先污水生物处理中的水样，除了含有微生物絮体，还有其他一些固体杂质， 胞外DNA分子容易吸附在这些固体颗粒上，很难获得。其次，如同时提取污水水样中的胞内 胞外DNA，还需防止污水微生物细胞裂解后的胞内DNA污染胞外DNA。
但目前尚未见适于同时提取污水生物处理水样中微生物胞内和胞外DNA的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适用于从污水生物降解工艺过程中的水样同时提取其中微生 物胞内和胞外DNA的方法。
本发明包括以下步骤：
1、预处理
取污水样品10mL，加入NaH2PO4溶液和聚乙烯基吡咯烷酮，常温条件下放置摇床震荡混 匀，得预处理样品;
2、分离胞内和胞外DNA
1)将步骤1预处理所得样品进行离心，得到沉淀物A和上清液A;
2)将步骤1)所得沉淀物A重悬于NaH2PO4溶液中，得重悬液A;
3)将步骤1)所得上清液A用无菌滤膜过滤，收集滤液放冰盒内保藏，含截留物的滤膜 重悬于NaH2PO4溶液中震荡，滤膜洗脱截留物后弃除，得重悬液B;
4)合并重悬液A和重悬液B，再重复步骤1)～3)，得到重悬液C，另将冰盒内保藏的 样品合并得总滤液;
5)将重悬液C和总滤液分别进行离心，分别得到沉淀物B1和沉淀物B2，以及上清液B1 和上清液B2;将沉淀物B1和沉淀物B2合并，得沉淀物C，沉淀物C用于提取胞内DNA，将 上清液B1和上清液B2合并，得上清液C，上清液C用于提取胞外DNA;
3、提取纯化胞内DNA
1)将沉淀物C加入DNA提取缓冲液和玻璃珠,涡旋震荡，然后加入SDS缓冲液，得混 合液;
2)将步骤1)得到的混合液采用冻融法破胞，即将混合液交替进行液氮浴和水浴，然后 进行离心，离心后所得上清液D置于冰盒内保藏，离心后所得沉淀物D重悬于DNA提取缓冲 液中，得重悬液D;
3)将重悬液D进行涡旋震荡后水浴，再加入SDS缓冲液，然后水浴，接着离心，将离 心后所得上清液E置于冰盒内保藏;
4)对上清液E采用商用试剂盒纯化DNA，得到胞内DNA;
4、提取纯化胞外DNA
将步骤2中的步骤5)所得上清液C加入CTAB后水浴，接着离心，离心后转移上清液， 然后利用商用试剂盒纯化其中DNA，得到胞外DNA。
下面进一步给出较佳的附加技术条件：
在步骤1中，所述NaH2PO4溶液为0.12M，pH 8.0;NaH2PO4溶液加入量9～11mL;所述 聚乙烯基吡咯烷酮加入量为0.5～1.5g。
在步骤2中，所述NaH2PO4溶液为0.12M，pH 8.0;所述无菌滤膜的孔径为≥0.22μm; 所述重复步骤1)～3)的次数可为1～5次;所述离心的条件为：离心温度4℃，离心力≥ 10000g，离心时间10～20min。
在步骤3中，其中步骤1)使用的DNA提取缓冲液成分包括100mM Tris-HCl、100mM Na2-EDTA、100mM Na3PO4、1.5M NaCl、1%CTAB以及0.001～0.1mg/mL蛋白酶K;DNA提 取缓冲液的加入量是3～5mL;所述玻璃珠的直径为1mm，玻璃珠加入量是0.5～1g;所述 SDS缓冲液为浓度10%SDS缓冲液，10%SDS缓冲液加入量为1～3mL;其中步骤2)所述将 混合液交替进行液氮浴和水浴的次数可为1～5次;所述液氮浴的时间为1min，水浴的温度 为60℃，水浴的时间为20min;所述离心的条件为：离心温度4℃，离心力≥13000g，离心 时间≥20min;其中步骤3)所述涡旋震荡的转速为2500rpm，时间为5min，水浴的温度为 37℃，水浴的时间为2h;所述SDS缓冲液为浓度10%SDS缓冲液，10%SDS缓冲液加入量是 1～3mL。
在步骤4中，所述CTAB的浓度为1%(w/v)，1%CTAB的加入量与上清液C的体积比为1∶ 1;水浴的温度为65℃，水浴的时间为30min;所述离心的条件为：离心温度4℃，离心力 ≥13000g，离心时间≥20min。
与现有技术比较，本发明的有益效果如下：
本发明可以从活性污泥法等生物处理污水样品中同时提取胞内和胞外DNA并进行准确定 量，收率高，纯度高，并且菌体裂解的交叉污染小，简单易行，非常适合对含大量微生物的 污水样品进行对比实验和科学研究使用，也具有开发加工成商业分析试剂盒的应用前景。在 步骤1中加入NaH2PO4和聚乙烯基吡咯烷酮，不仅可以去除腐殖酸等杂质，而且对菌体细胞有 保护缓冲作用，防止细胞裂解造成胞内DNA污染胞外DNA。解决了目前胞外DNA容易被胞内 DNA污染，不宜获得的难题。在其它步骤中使用离心和过滤等物理手段，可避免使用化学方 法对DNA造成污染，同时NaH2PO4溶液对菌体细胞有保护缓冲作用。在步骤3中的步骤1)中 使用的SDS缓冲液对污水中高浓度的菌体有很好的裂解效果，充分提高了DNA的回收率。步 骤4提取胞外DNA过程中采用CTAB法，未添加其他对DNA有吸附作用的物质，利用高速离心 一次性沉淀杂质，充分避免了胞外DNA的损失。
