申请日2015.10.15
公开(公告)日2017.04.26
IPC分类号C12N7/00; C12R1/92
摘要
本发明涉及用于污水处理系统中高致病性肠出血性大肠杆菌O157的防控，属生物工程领域。提供了一株裂解污水处理系统中肠出血性大肠杆菌O157的新型噬菌体，命名为PE-3(基因序列SEQ ID NO.1，GenBank Access no.KJ748011)。该噬菌体为T7短尾噬菌体科，其头部为正六面体立体对称，直径约50nm;尾部较短，长度与宽度均约12nm，其基因组全长为39,093bp。该噬菌体对肠出血性大肠杆菌O157具有强裂解效用，可有效防控肠出血性大肠杆菌O157的产生及传播，且具有较高的温度耐受性和较宽的酸碱耐受范围，有利于工业化的生产制备，该噬菌体可作为一种安全可靠高效的生物消毒剂，迅速高效的防治污水排放或回用引发的肠出血性大肠杆菌O157污染。
权利要求书
1.一株从污水处理系统中分离的新型肠出血性大肠杆菌O157的噬菌体菌株，其全基因序列为SEQ IDNO.1的序列，其为T7短尾噬菌体科，头部呈正六面体立体对称状，直径约50nm;尾部较短，长度与宽度均约12nm，其基因组全长为39,093bp。
2.根据权利要求1所述的该噬菌体为烈性噬菌体，其对污水处理系统中肠出血性大肠杆菌O157具有强裂解效用，为工业化生产噬菌体及用于污水排放和污水回用中肠出血性大肠杆菌O157的防治提供了噬菌体来源。
3.根据权利要求1所述的一株新型肠出血性大肠杆菌O157的噬菌体菌株，其特征在于：噬菌体菌株在pH 6～10中作用16小时，其效价较高，可在1×108pfu/mL以上，具有明显的嗜碱性;在pH为12时，效价最低达5.45×106pfu/mL;而在pH为1的强酸性环境中，该噬菌体仍能存活，其效价可保持在1×105pfu/mL以上。可见该噬菌体的酸碱耐受性较强且耐受范围较宽。
4.根据权利要求1所述的该噬菌体PE-3在40℃活性最强，效价达1×109pfu/mL;其在0℃下，仍可保持良好的活性，效价可在108pfu/mL以上;此外，其在60℃作用90min后，依然保持有生物活性。
5.根据权利要求1所述的噬菌体，其特征在于可高效感染宿主菌肠出血性大肠杆菌O157，其最佳感染复数为0.01。
6.根据权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，可单独投加噬菌体PE-3菌液且依据最佳感染复数0.01投加，可在投加40分钟后，即对宿主菌肠出血性大肠杆菌O157菌液出现明显的裂解效果，具有较强的裂解活性，具有良好的应用前景。
说明书
污水处理系统中一株新型肠出血性大肠杆菌O157噬菌体PE-3的分离及鉴定
技术领域
本发明涉及用于污水处理系统中高致病性肠出血性大肠杆菌O157的防控，属于生物工程领域。特别地，本发明涉及对从污水处理系统中的一株新型噬菌体PE-3(基因序列SEQ IDNO.1，GenBank Access no.KJ748011)的分离及基本生物学特性鉴定，尤其是其能够快速高效裂解肠出血性大肠杆菌O157及其基本特性的鉴定。
背景技术
近来，水体由于受到病原菌的污染，常常引起水媒型传染性疾病的爆发。而仅由水媒型传染病导致的死亡数已达全世界总死亡人数的4%。其中，肠出血性大肠杆菌(EHEC)因其具有高致病性，严重危害人类健康，已成危害公共健康安全的世界性问题。自2011年5月中旬，德国爆发肠出血性大肠杆菌感染到2011年6月15日，仅仅一月，已引起3343人感染，37人死亡。另有研究发现，所有肠出血性大肠杆菌血清型中以O157的致病性最强，其在所有肠出血性大肠杆菌引起的患病例中占有率高达50%-80%，是引起严重感染的最主要病菌。此外，研究者对在美国1971-2000年间，因娱乐用水爆发的感染性疾病统计研究发现，有6%是由肠出血性大肠杆菌引起的，而引起此疾病传播的重要原因便是污水处理厂的污水排放。可见，严控污水处理厂中肠出血性大肠杆菌向环境中的排放具有十分重要的现实意义。
噬菌体生物防治技术，因其具有增值快，高度特异性及其他一些物理、化学防治技术无法比拟的优点，得到广泛的重视和研究。截至目前，利用噬菌体防治肠出血性大肠杆菌的研究工作已大量展开，但其防治研究重点主要集中于食品和动物的感染上，而鲜有针对污水处理系统中病原菌的防治研究工作。
发明内容
本发明目的在于：针对目前缺乏有效对污水处理系统中高致性水媒型肠出血性大肠杆菌O157引发疾病的防范和控制，提供一种新型生物防治且具有高效特异性裂解肠出血性大肠杆菌O157的噬菌体防治疗法;
本发明的另一目的在于提供分离的强裂解性噬菌体制剂，该制剂对高致病性肠出血性大肠杆菌具有实质性的裂解效果;
进一步，该噬菌体对肠出血性大肠杆菌O157具有强裂解效用，为工业化生产噬菌体及用于污水处理系统防控杀菌提供了噬菌体来源。
本发明另一目的是通过对其形态、核酸类型及其生物学特性进行鉴定，进一步深入了解该噬菌体特性，为污水处理系统出水和剩余污泥中肠出血性大肠杆菌O157的生物防治提供进一步的理论和技术支持。
1、本发明中，该株噬菌体PE-3((基因序列录入号，GenBank Access no.KJ748011)，其具有包含SEQ ID NO.1的核酸序列的基因组并显示出对肠出血性大肠杆菌O157具有强裂解效用。该噬菌体是通过标准的病毒分离方法，从北京市某城市污水处理厂曝气池中分离纯化所得。
2、该噬菌体该噬菌体为T7短尾噬菌体科，其头部为正六面体立体对称，直径约50nm;尾部较短，长度与宽度均约12nm，其基因组全长为39,093bp，含有可能的编码区序列(CDSs)48个。
3、在一个实施方式中，该噬菌体单个噬菌斑经6次反复纯化后，经双层平板测定其效价可达8.7×1011pfu/mL。
4、在另一个实施方式中，以纯化噬菌体与宿主菌肠出血性大肠杆菌O157不同混合比例(0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10和100)裂解测验发现，采用噬菌体PE-3：肠出血性大肠杆菌O157为0.01，投加噬菌体，可产生最高的感染效果。即以较低的投入，可对宿主菌达到最优的裂解效果，
5、在另一个实施方式中，以最佳混合比投加的纯化噬菌体，可在投加至宿主菌液后，较短时间内表现出明显的裂解效用，进一步显示其对出血性大肠杆菌O157具有迅速有效的裂解防治作用。
6、在另一个实施方式中，本发明中噬菌体PE-3不仅表现出了较宽的酸碱耐受性，具有较强的强酸和强碱抗性，而且在热稳定性上也表现出了良好特性，具有较宽的温度耐受范围。这有利于噬菌体制剂的进一步制备和加工，且不会因为理化因素的变化而失活。
本发明的主要优点在于：根据本发明选择的噬菌体PE-3在裂解肠出血性大肠杆菌O157实验表现出快速高效的裂解效用，可迅速高效用于污水处理系统排放污水和污泥中肠出血性大肠杆菌O157的超标和爆发性状况的防治;由于本发明涉及的噬菌体PE-3具有较高的效价(活性)及良好的感染复数，可用于肠出血性大肠杆菌O157的高效防控;由于本发明涉及的噬菌体PE-3具有较高的温度耐受性和较宽的酸碱耐受范围，可保证噬菌体制剂的制备过程中，具有良好的物理和化学抗性，保持良好裂解活性，为进一步工业化生产噬菌体及其用于防控杀灭污水处理系统肠出血性大肠杆菌O157提供了噬菌体来源;该噬菌体还可作为一种安全可靠高效的生物消毒剂，防治污水回用引发的肠出血性大肠杆菌O157污染。
