申请日2013.04.26
公开(公告)日2013.07.24
IPC分类号C12N15/10
摘要
本发明涉及一种SBR中活性污泥样品DNA的提取方法,包括：污泥样品前处理、破碎、蛋白质的去除、DNA的分离提纯、基因组DNA纯化、DNA的紫外分光光度分析、DNA琼脂糖凝胶电泳检测。本发明具有快速，高效的特点，可以高效提取印染废水或相同的水质情况废水的活性污泥基因组DNA，具有良好的应用前景。
权利要求书
1.一种SBR中活性污泥样品DNA的提取方法，包括：
(1)活性污泥样样品在处理前首先混匀，采用TENP、PBS溶液和玻璃珠震荡法对样品进行 预处理;将经预处理的污泥样品采用冻融法破碎，冷藏、沸水煮，再加入质量百分比浓度 2%～10%的SDS缓冲液去除蛋白质;
(2)加入0.6倍样品体积的异丙醇，颠倒混匀，进行沉淀;离心，倒掉上清液;自然风干， 用TE缓冲液悬浮样品，溶解沉淀，即得基因组DNA粗提液;加入RNase A，35～40℃温浴 15-20min消化RNA，然后采用DNA胶回收试剂盒，按照操作说明进行纯化;
(3)用紫外分光光度计测定上述纯化DNA样品在波长230、260、280nm处的吸光光度值; 将上述纯化DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后，用紫外凝胶成像系统拍照。
2.根据权利要求1所述的一种SBR中活性污泥样品DNA的提取方法，其特征在于：所述步 骤(1)中的TENP溶液体积和PBS溶液体积为污水样品的3～5倍;玻璃珠直径为1～2mm， 3000～5000rpm离心10～30min。
3.根据权利要求1所述的一种SBR中活性污泥样品DNA的提取方法，其特征在于：所述步 骤(1)中的冷藏、沸水煮具体为：置于-25～-15℃冰箱中冷藏1～2h，沸水煮10～20min，重 复一次。
4.根据权利要求1所述的一种SBR中活性污泥样品DNA的提取方法，其特征在于：所述步 骤(1)中冷藏、沸水煮后，加入2～4ml Extraction buffer，1～5粒玻璃珠，漩涡5～10min。
5.根据权利要求1所述的一种SBR中活性污泥样品DNA的提取方法，其特征在于：所述步 骤(1)中的SDS缓冲液的质量百分比浓度为2%。
6.根据权利要求1所述的一种SBR中活性污泥样品DNA的提取方法，其特征在于：所述步 骤(2)中的沉淀具体为放入冰箱内沉淀1～2h或过夜沉淀。
7.根据权利要求1所述的一种SBR中活性污泥样品DNA的提取方法，其特征在于：所述步 骤(2)中的TE缓冲液的用量为100μL。
8.根据权利要求1所述的一种SBR中活性污泥样品DNA的提取方法，其特征在于：所述步 骤(2)中的RNase A的浓度为10mg/mL，用量为4μL。
9.根据权利要求1所述的一种SBR中活性污泥样品DNA的提取方法，其特征在于：所述步 骤(3)中的琼脂糖凝胶质量百分比浓度为1%，电压为100～110V，电泳0.5～1h。
说明书
一种SBR中活性污泥样品DNA的提取方法
技术领域
本发明属于DNA的提取领域，特别涉及一种SBR中活性污泥样品DNA的提取方法。
背景技术
活性污泥中细菌总DNA提取的不同方法得到的DNA纯度不同，分析DNA的纯度，用 于了解微生物的群落结构，对鉴定和分离处理系统中的优势菌很重要。力求通过这多方面的 研究来提高生物处理染料废水处理能力。DNA提取是分子学技术的前提条件。只有提取出了 足够的并且纯度适宜的DNA,才能进行后续的实验和研究，所以DNA的提取可以说是分子生 物学的关键所在。
关于活性污泥中细菌总DNA提取方法：提取活性污泥DNA时，对样品进行预处理是非 常必需的。活性污泥中含有大量的腐殖酸、褐菌素和重金属离子等杂质，还有一些胞外游离 的DNA，它们都极大地影响DNA提取以及后续工作，采用TENP和PBS缓冲液对污泥样品 进行预处理，可以去除污泥样品中的腐殖酸、各种离子、无机物及有机物等杂质，减少胞外 游离DNA的污染。
细胞裂解是破坏细胞壁和细胞膜的过程。常用的裂解方法有化学、酶和机械裂解。本实 验采用化学裂解法直接从废水样品中提取基因组DNA。蛋白的去除使用的是传统的苯酚氯仿 抽提法。核酸的沉淀一般选择在乙醇、异丙醇等溶剂中进行，使用异丙醇可以得到较高产量 的DNA并且腐殖酸的含量较低，故本实验中选用异丙醇来沉淀DNA。沉淀得到的DNA通 常会含有腐殖酸和酚类化合物等杂质，这些杂质会影响到后续的分析，特别是PCR扩增。低 量的腐殖酸会抑制PCR反应，使其得不到任何产物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种SBR中活性污泥样品DNA的提取方法，该方法 具有快速，高效的特点，可以高效提取印染废水或相同的水质情况废水的活性污泥基因组 DNA，具有良好的应用前景。
本发明的一种SBR中活性污泥样品DNA的提取方法，包括：
(1)活性污泥样样品在处理前首先混匀，使其中的悬浮物质分布均匀;采用TENP、PBS溶 液和玻璃珠震荡法对样品进行预处理;将经预处理的污泥样品采用冻融法破碎，冷藏、沸水 煮，再加入质量百分比浓度2%～10%的SDS缓冲液去除蛋白质;
(2)加入0.6倍样品体积的异丙醇，颠倒混匀，进行沉淀;离心，倒掉上清液;自然风干， 用TE缓冲液悬浮样品，溶解沉淀，即得基因组DNA粗提液;加入RNase A，35～40℃温浴 15-20min消化RNA，然后采用DNA胶回收试剂盒，按照操作说明进行纯化;
(3)用紫外分光光度计测定上述纯化DNA样品在波长230、260、280nm处的吸光光度值; 将上述纯化DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后，用紫外凝胶成像系统拍照。
所述步骤(1)中的TENP溶液体积和PBS溶液体积为污水样品的3～5倍;玻璃珠直径 为1～2mm，3000～5000rpm离心10～30min。
所述步骤(1)中的冷藏、沸水煮具体为：置于-25～-15℃冰箱中冷藏1～2h，沸水煮 10～20min，重复一次。
所述步骤(1)中冷藏、沸水煮后，加入2～4ml Extraction buffer，1～5粒玻璃珠，漩涡 5～10min。
所述步骤(1)中的SDS缓冲液的质量百分比浓度为2%。
所述步骤(2)中的沉淀具体为放入冰箱内沉淀1～2h或过夜沉淀。
所述步骤(2)中的TE缓冲液的用量为100μL。
所述步骤(2)中的RNase A的浓度为10mg/mL，用量为4μL。
所述步骤(3)中的琼脂糖凝胶质量百分比浓度为1%，电压为100～110V，电泳0.5～1h。
采用加2%SDS缓冲液和加10%SDS缓冲液作对比，并根据上面结果结合冻融法对经预处 理方法处理后的样品进行分析比较，加2%SDS的提取效果要好于10%SDS。
本发明以印染废水SBR系统为研究对象，对从反应器内提取的活性污泥样品经过或未经 预处理两种情况下的污泥样品，采用玻璃珠震荡法和冻融法两种细胞裂解方法，比较各自 DNA提取效果的影响，以期建立一种快速、高效且适用于分子生物学后续分析的活性污泥基 因组DNA提取新方法。通过吸光度和琼脂糖凝胶电泳检测的结果表明：活性污泥经TENP 和PBS预处理后采用冻融法加2%SDS裂解细胞的DNA提取操作，可以得到数量多、纯度高 的活性污泥DNA样品。
有益效果
本发明具有快速，高效的特点，可以高效提取印染废水或相同的水质情况废水的活性污 泥基因组DNA，具有良好的应用前景。
