申请日2012.06.20
公开(公告)日2013.06.19
IPC分类号C12N15/11; C12Q1/68
摘要
本发明公开了一种检测污泥中四环素类抗性基因tetG的引物序列及方法，引物序列包括正向引物和反向引物，其碱基序列为：正向引物：TTATCGCCGCCGCCCTTCT;反向引物：TCATCCAGCCGTAACAGAAC。检测污泥中四环素类抗性基因tetG的方法包括：(1)提取待测污泥样品中的DNA，以提取的DNA为模板，用所述的正向引物和反向引物进行定量PCR扩增并记录达到荧光阈值时的循环数;(2)将步骤(1)中得到的循环数参照定量PCR测定目的基因tetG质粒标准品的标准曲线，得到待测污泥样品中四环素类抗性基因tetG的含量。本发明的引物序列和方法实现了污泥样品中四环素类抗性基因tetG的快速精确定量检测。
权利要求书
1.一种检测污泥中四环素类抗性基因tetG的方法，其特征在于，包 括：
(1)提取待测污泥样品中的DNA，以提取的DNA为模板，用以下 正向引物和反向引物进行定量PCR扩增并记录达到荧光阈值时的循环数，
其中，正向引物和反向引物的碱基序列为：
正向引物：TTATCGCCGCCGCCCTTCT;
反向引物：TCATCCAGCCGTAACAGAAC;
(2)将步骤(1)中得到的循环数参照定量PCR测定目的基因tetG 质粒标准品的标准曲线，得到待测污泥样品中四环素类抗性基因tetG的含 量;
所述定量PCR的反应体系为：2ul DNA溶液，7.5ul SYBR Premix Ex Taq溶液，0.3ul ROX Reference溶液，0.3ul浓度为10mM的正向引物， 0.3ul浓度为10mM的反向引物，4.6ul ddH2O。
说明书
一种检测污泥中四环素类抗性基因tetG的引物序列及方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种检测污泥中四环素类抗性 基因tetG的引物序列及方法。
背景技术
抗生素是20世纪最重要的医学发现之一，长期以来，抗生素在医疗 领域的广泛应用，对控制人类感染性疾病发挥了巨大的作用。同时，由 于兽药抗生素能够预防动物疾病和一定程度上促进生长的双重功效，因 此，常以亚治疗剂量长期添加于动物饲料中，出现在养殖业和畜牧业中。 由于抗生素在畜牧业和养殖业中的长期滥用，在养殖动物肠道内诱导出抗 性菌株，这些编码抗生素抗性基因的菌株是环境中抗生素抗性基因最重要 的来源，携带抗性基因的抗性细菌如果在全球传播，可能导致大范围的对 环境生物、人类健康和社会经济的潜在不利影响。环境中的抗生素抗性基 因的污染越来越被人们视为一种生态性问题。
相关研究表明，污水处理厂因为进水中包含重金属、抗生素、洗涤剂、 季铵盐等物质，这些物质也可以协同或交叉引起微生物抗药性，且污水处 理厂微生物分布密集，极易诱导微生物产生抗性基因;而污水处理厂出水 被认为是受纳水体中抗生素抗性基因的主要来源。并且也有相关研究指 出，污水处理厂污泥中可以检出多种四环素类抗性基因，抗性基因不仅种 类丰富，相对含量也较高。
近些年来，我国污水处理工作也在高速发展中，污水处理厂在解决我 国水污染问题方面起到了巨大的作用，然而，污水处理厂的高速发展，产 生的污泥问题也日益突出，因此对于污泥中抗性基因进行精确定量意义重 大。
近年来有许多关于微生物对四环素和其他类抗生素表型抗性的研究， 然而目前研究所采用的方法只能研究可培养微生物的抗性，而对不可培养 微生物的抗性及微生物体内导致这些抗性的特定基因无法检测。因此近年 来越来越多的研究采用实时荧光定量PCR(Real-time quantitive PCR)技 术作为研究手段，从数量上更为直观地探讨环境中抗性基因的变化，而且 由于这种方法不依赖于微生物培养，因此也能检测不可培养微生物所携带 的抗性基因，使最终得到的量化结果更为全面和可信。
目前国外对环境中四环素抗性基因的定量研究主要集中于水环境，国 内关于环境中抗生素抗性基因的研究才刚刚起步，而污水处理厂经常被认 为是抗性基因的重要储存库，因此对于污泥中四环素类抗药基因为精确定 量是十分必要的。
发明内容
本发明提供了一种检测污泥中四环素类抗性基因tetG的引物序列及 方法，能对城市污水处理厂污泥中四环素类抗药基因tetG进行快速精确定 量。
一种检测污泥中四环素类抗性基因tetG的引物序列，包括正向引物和 反向引物，其碱基序列为：
正向引物：TTATCGCCGCCGCCCTTCT;
反向引物：TCATCCAGCCGTAACAGAAC。
本发明还提供了一种利用所述的引物序列检测污泥中四环素类抗性 基因tetG的方法，包括：
(1)提取待测污泥样品中的DNA，以提取的DNA为模板，用所述 的正向引物和反向引物进行定量PCR扩增并记录达到荧光阈值时的循环 数;
(2)将步骤(1)中得到的循环数参照定量PCR测定目的基因tetG 质粒标准品的标准曲线，得到待测污泥样品中四环素类抗性基因tetG的含 量。
所述定量PCR的反应体系为：2ul DNA溶液，7.5ul SYBR Premix Ex Taq溶液，0.3ul ROX Reference溶液，0.3ul浓度为10mM的正向引物， 0.3ul浓度为10mM的反向引物，4.6ul ddH2O。
步骤(2)中所述标准曲线的标准品的制备方法为：利用所述的正向 引物和反向引物做普通PCR扩增;扩增序列用商业化凝胶回收试剂盒纯 化;纯化后测量DNA含量、纯度并调节至合适浓度;接入载体并转化入 感受态细胞;将感受态细胞涂于含有氨苄青霉素、X-gal和IPTG的LB固 体培养基上培养12-16h，通过蓝白斑筛选挑取白色重组菌斑，挑选白色阳 性克隆子用LB培养液扩大培养;待菌液混浊后，取1ml菌液送公司测序 插入的基因片断，其余3-4ml菌液用来提取质粒;使用微量核酸蛋白质分 析仪检测提取质粒的含量及纯度，确保质粒DNA的A260/A280比值在1.8 左右，符合要求的质粒作为标准品绘制标准曲线。
所述DNA的提取方法为：用FastDNA Spin Kit for soil试剂盒提取。 采用该方法提取DNA具有以下优点：(1)节约时间，只需要2个小时即 可提取到样品的DNA，与传统的有机溶剂抽提法相比可以减少预处理的 时间;(2)DNA提取效率稳定，且不易发生DNA降解，提取结果具有很 好的重复性;(3)避免使用三氯甲烷等有机溶剂，保障实验操作人员的工 作环境。
本发明的有益效果：
(1)本发明的方法不依赖于微生物培养，与传统微生物培养法相比， 也能检测不可培养微生物所携带的抗性基因，使最终得到的量化结果更为 全面和可信，并且用FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒提取的DNA样品可 以保存半年甚至多年，有利于将不同季节、不同地区污泥样品进行对比分 析;
(2)通过普通PCR反应，可以确定污泥中四环素类抗性基因tetG的 存在与否;通过实时荧光定量PCR反应，可以确定污泥中四环素类抗性 基因tetG含量，为污泥处置提供技术指导;
(3)优化了定量PCR实验的反应液体系，对于反应孔壁上残留液， 通过多次混匀离心以及添加ROX校准染料克服移液误差，将反应体系减 少为15ul，而一般实验需要20ul甚至更多的反应液才能得出准确的数据， 大大节约了检测成本，使得高通量检测成为可能。
