申请日2012.06.07
公开(公告)日2012.10.10
IPC分类号C12N15/10
摘要
一种饮用水处理中活性炭生物膜的核酸提取方法，涉及环境工程饮用水深度处理生物活性炭工艺单元中微生物学技术领域。该方法首先采用脱腐缓冲液对活性炭颗粒进行脱腐处理，再进行水浴和超声洗脱。具体方法为采用NaOH溶液或NaOH与聚乙烯吡咯烷酮混合溶液作为脱腐缓冲液对活性炭进行脱腐处理，超声波洗脱和化学裂解后提取生物活性炭上的微生物核酸。所获总DNA长度在20Kb以上，完全满足PCR分析的要求。解决了生物活性炭上因生物量少且和载体颗粒结合紧密导致的洗脱困难问题，减少了腐殖酸对微生物核酸提取的不利影响，微生物细胞充分裂解。该方法操作简便，DNA产量大，纯度高。
权利要求书
1.一种饮用水处理中活性炭生物膜的核酸提取方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
1)生物活性炭的脱腐处理：将生物活性炭与脱腐缓冲液按质量/体积比为1∶8～1∶15混合，脱腐缓冲液采用NaOH溶液，或采用NaOH与聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液，混合后旋涡振荡，再离心处理，得到脱腐后的生物活性炭;
2)生物活性炭的超声洗脱处理：将脱腐后的生物活性炭溶于去离子水中，旋涡振荡及常温水浴后进行超声洗脱处理;
3)将步骤2)中超声后的悬浊液离心弃上清液，进行核酸纯化提取。
2.根据权利要求1所述的一种饮用水处理中活性炭生物膜的核酸提取方法，其特征在于：步骤1)中脱腐缓冲液NaOH的摩尔浓度为50mmol/L～200mmol/L，所述混合溶液中聚乙烯吡咯烷酮与NaOH质量比为5∶1至10∶1。
3.根据权利要求1所述的一种饮用水处理中活性炭生物膜的核酸提取方法，其特征在于：步骤1)中离心速度为1000rpm以上，离心时间至少为5min;步骤2)中超声洗脱时间为1min～5min，超声频率为45~100kHz。
说明书
一种饮用水处理中活性炭生物膜的核酸提取方法
技术领域
本发明涉及一种饮用水处理中生物活性炭上的微生物核酸提取方法,属于饮用水深度处 理技术领域。
背景技术
活性炭由于具有良好的吸附性能和化学性能稳定，可耐强酸及强碱，能经受水浸和高温， 比水轻，是多孔的疏水性吸附剂，故已广泛用于去除饮用水中的臭味、色度、天然及人工合 成有机物。活性炭上附着的以微生物及其胞外多聚物为主体的生物膜是水体中有害物质生物 降解的主要部分。因此鉴定分析活性炭表面微生物群落结构和分布对于明确饮用水深度处理 中活性炭生物降解机制以及微生物泄露导致的健康风险具有重要意义。
传统的微生物检测是建立在微生物分离培养基础上的，检测周期长，操作复杂，特异性 不强。同时环境中的大量微生物无法实现人工培养，或者在培养过程中群落结构由于生存环 境的改变而改变，因此仅靠现有的微生物培养技术不能全面地反映所在环境的微生物多样性。 分子生物学技术于是成为了研究生物活性炭微生物群落的主要手段。
利用十六烷基三甲基溴化铵(Cetyilrt methyl ammonium bromide，CTAB)在一定盐度 下与核酸形成沉淀提取DNA是常用的方法。CTAB是一种阳离子去污剂，能够与核酸形成复合 物。该复合物在高盐(>0.7mol/L)浓度下可溶，并稳定存在，当盐浓度降低到0.1～0.15mol/L 时，CTAB-核酸复合物溶解度降低形成沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。然 后通过有机溶剂抽提，去除蛋白质、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀使核酸分离出来，最 后洗脱掉CTAB即可。十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)是一种阴离子表面 活性剂，可以和生物膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用而破坏膜结构，同时还会破坏酶的空间 结构，影响酶的催化活性。提取DNA时，常利用高浓度的SDS(0.5%以上)在较高温度下(55～ 65℃)裂解细胞并钝化核酸酶以减小DNA的降解。
然而，由于处理饮用水的生物活性炭上的生物量相对少，并且和载体颗粒结合紧密，所 以菌体很难直接从活性炭上洗脱下来。另一方面，活性炭上吸附的腐殖酸在自然条件下不易 发生生物降解，又表现出极性、氧化还原性、络合与吸附等多重理化性质，在经典的DNA提 取过程中与粘粒及金属离子等相互作用而将微生物裹挟其中，阻止SDS等变性剂的渗透并抑 制溶菌酶及蛋白酶K等的活性，影响裂解缓冲液对微生物的裂解。同时经碱性裂解液处理后 溶出的黄腐酸与棕腐酸既能氧化为醌，又能还原为酚，会导致部分DNA随氧化的苯酚进入有 机相而丧失。即使采用透析、离子交换、密度梯度离心、层析和电泳等不同方法对核酸粗提 物进行进一步纯化，仍有一些理化性质与核酸相近的腐殖酸组分与之共存，从而影响到核酸 的定量及后续的PCR扩增等技术过程。传统的DNA提取方法和市售DNA提取试剂盒都不能有 效解决上述问题，因此如何在裂解细胞前采用去除腐植酸的预处理和有效微生物洗脱方法就 成为从生物活性炭上获得高产量且高纯度的DNA的关键。
发明内容
本发明目的在于解决现有技术中由于生物活性炭上生物量少且与载体颗粒结合紧密导致 的洗脱困难问题，减少腐殖酸对微生物核酸提取不利影响，通过脱腐处理和超声波洗脱方法， 提供一种有效提取生物活性炭上微生物核酸的方法，以获得产量和纯度均达到适用于下游分 子生物学操作的DNA片段。
本发明的技术方案如下：
一种饮用水处理中活性炭生物膜的核酸提取方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
1)生物活性炭的脱腐处理：将生物活性炭与脱腐缓冲液按质量/体积比为1∶8～1∶15 混合，脱腐缓冲液采用NaOH溶液，或采用NaOH与聚乙烯吡咯烷酮的混合溶液，混合后旋涡 振荡，再离心处理，得到脱腐后的生物活性炭;
2)生物活性炭的超声洗脱处理：将脱腐后的活性炭溶于去离子水中，旋涡振荡及常 温水浴后进行超声洗脱处理;
3)将步骤2)中超声后的悬浊液离心弃上清液进行纯化提取，即获得DNA;
上述技术方案中，步骤1)中脱腐缓冲液NaOH的摩尔浓度为50mmol/L～200mmol/L，所 述混合溶液中聚乙烯吡咯烷酮与NaOH质量比为5∶1至10∶1;步骤1)中离心速度为1000rpm 以上，离心时间至少为5min;步骤2)中超声洗脱时间为1min～5min，超声频率为45～100kHz。
本发明的具有以下优点及突出性效果：
①脱腐缓冲液脱腐能力高，减少了腐殖酸对微生物核酸提取的不利影响。②超声处理活 性炭克服了饮用水生物活性炭上因生物量少且和载体颗粒结合紧密导致的洗脱困难。
总之，本发明克服了传统方法提取核酸(DNA)的缺陷，且操作简单，能够从生物活性炭 上获得高产量且高纯度的DNA。
