申请日2010.01.12
公开(公告)日2011.07.20
IPC分类号C12R1/125; C12N1/20
摘要
本发明涉及一种利用马铃薯淀粉废水培养枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的方法，属于生物技术领域。其特征在于：发酵培养基以马铃薯淀粉废水为主要营养物质来源，培养步骤包括：培养基配制、菌种活化、液体种子制备、液态发酵、菌剂制备。由本发明技术方案生产的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)能高效原位降解蔬菜叶片上有机磷农药残留，促进蔬菜生长，降低蔬菜中硝酸盐和亚硝酸盐的含量，保障食品安全;本发明技术方案还能有效资源化马铃薯淀粉废水，减少高浓度废水排放，保护生态环境。
翻译权利要求书
1.利用马铃薯淀粉废水培养枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的方法，其特征在于：发酵培
养基以马铃薯淀粉废水为主要营养物质来源，培养步骤包括：
(1)培养基配制：
1)菌种保藏培养基(固体)：硫酸铵0～3g，磷酸氢二钾0～2g，硫酸镁0～0.1g，琼脂20g，加马铃薯淀粉废水至1L，pH 7.0-7.5;
2)菌种活化培养基(液体)：硫酸铵0～3g，磷酸氢二钾0～2g，硫酸镁0～0.1g，加马铃薯淀粉废水至1L，pH 7.0-7.5;
3)种子培养基(液体)：硫酸铵0～30g，磷酸氢二钾0～20g，硫酸镁0～1.0g，加马铃薯淀粉废水至10L，pH 7.0-7.5;
4)发酵培养基(液体)：硫酸铵0～0.5kg，磷酸氢二钾0～0.4kg，硫酸镁0～20g，加马铃薯淀粉废水至200L，pH 7.0-7.5;
以上培养基均在121℃灭菌15-30min;
(2)菌种转接与活化：挑取斜面保存的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)至菌种保藏培养基平板，35℃连续划线、挑单菌落培养两次后，挑取单菌落在菌种活化培养基中，于35℃，150-200r/min摇床振荡培养12-24h;
(3)液体种子制备：向装有高温灭菌的种子培养基的发酵罐中，按照5%-20%的接种量接种步骤2活化的有机磷农药降解菌，于25-37℃，通空气培养12-24h，得到液体种子;
(4)液态发酵：向装有高温灭菌的发酵培养基的发酵罐中，按照5%-20%的接种量接种步骤3制备的有机磷农药降解菌液体种子，于25-37℃，通空气培养18-60h，得到活菌体培养物，菌体浓度达到60亿CFU/mL以上;
(5)菌剂制备：培养好的发酵液经细菌计数后，加入甘氨酸(质量分数0.2%-2%)和甘油(质量分数0.2%-5%)，灌装保藏。使用时用水稀释500-1000倍。
说明书
利用马铃薯淀粉废水培养枯草芽孢杆菌
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种利用高浓度有机废水培养枯草芽孢杆菌的方法。
技术背景
近年来，我国马铃薯产业发展迅速，在许多地区都形成了产业化基地。每年生产马铃薯淀粉总量达40多万吨，加工马铃薯近300万吨，排放废水800多万吨。这些工艺废水大部分排放于河流和水库中，造成严重污染。马铃薯淀粉废水中，造成污染的主要是蛋白液，占废水总量的25%左右。蛋白液中主要营养成分是马铃薯本身的蛋白质、多糖、矿物质等，总含量为4%-5.5%，其中蛋白质含量在0.9%～2.1%，化学需氧量(COD)含量在39000-45000mg/L。其污染机理和危害是，蛋白液被排放在河流水库中自然发酵后释放出硫化氢、氨气等气体，飘在空气中有一股恶臭味;在水中，由于有机质浓度太高，各种微生物生长繁殖很快，其中包括有害的微生物或者致病菌的大量生长繁殖，不仅可以直接侵害水生动物，而且由于微生物的生长和有机质的氧化反应，水中的溶解氧被消耗殆尽，使水生动物因缺氧而死亡(引自：《饲料广角》2007年第13期，32-34页)。
中国发明专利(申请号：200810063868.0)公开了一种投药气浮-UASB-SBR的方法处理淀粉废水。该方法主要是通过气浮池去除水中的悬浮物，气浮池出水流入UASB厌氧反应器，将大部分的有机物分解为无机小分子物质和甲烷，剩余污泥进入污泥浓缩池，出水流入预曝气沉淀池，预曝气沉淀池的出水自流进入SBR进行好氧生物处理。中国实用新型专利(申请号：200820131168.6)公开了一种马铃薯淀粉生产废水中蛋白质膜法回收装置，适用于淀粉生产废水中蛋白质的回收、浓缩、回收率在50%以上。中国实用新型专利(申请号：200720126184.1)公开了一种纳滤回收马铃薯淀粉生产废水中低聚糖装置，适用于废水中低聚糖的回收、浓缩、回收率在80%以上。中国实用新型专利(申请号：200620005277.4)公开了一种对马铃薯淀粉生产过程中产生的含有蛋白质的废水进行加热处理提取蛋白质的热处理设备。目前尚未发现文献报道用马铃薯淀粉废水培养枯草芽孢杆菌的方法。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)N14菌株是我们实验室从油菜的叶面上分离筛选出来的一株具有降解有机磷农药特性，并且能够促进植物生长的野生菌株。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2009年11月2日，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏编号为：CGMCC No.3374。该菌株的16S rDNA基因序列已经递交到了GenBank数据库，登录号为GU086422。在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站上用blast程序与已登录细菌菌株的16S rDNA基因序列进行比较，结果表明与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的相似性最高，可以达到99%以上。该菌株可以利用马铃薯淀粉废水中的有机质为营养物快速生长。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用马铃薯淀粉废水为主要原料，培养枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)N14菌株的方法，并且配制成菌剂，有利于保存和农业应用。
本发明所述的菌剂的生产方法如下：
1、培养基配制：
1)菌种保藏培养基(固体)：硫酸铵0～3g，磷酸氢二钾0～2g，硫酸镁0～0.1g，琼脂20g，加马铃薯淀粉废水至1L，pH7.0-7.5;
2)菌种活化培养基(液体)：硫酸铵0～3g，磷酸氢二钾0～2g，硫酸镁0～0.1g，加马铃薯淀粉废水至1L，pH7.0-7.5;
3)种子培养基(液体)：硫酸铵0～30g，磷酸氢二钾0～20g，硫酸镁0～1.0g，加马铃薯淀粉废水至10L，pH7.0-7.5;
4)发酵培养基(液体)：硫酸铵0～0.5kg，磷酸氢二钾0～0.4kg，硫酸镁0～20g，加马铃薯淀粉废水至200L，pH7.0-7.5;
以上培养基均在121℃灭菌15-30min。
2、菌种转接与活化：挑取斜面保存的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)至菌种保藏培养基平板，35℃连续划线、挑单菌落培养两次后，挑取单菌落在菌种活化培养基中，于35℃，150-200r/min摇床振荡培养12-24h;
3、液体种子制备：向装有高温灭菌的种子培养基的发酵罐中，按照5%-20%的接种量接种步骤2活化的有机磷农药降解菌，于25-37℃，通空气培养12-24h，得到液体种子。
4、液态发酵：向装有高温灭菌的发酵培养基的发酵罐中，按照5%-20%的接种量接种步骤3制备的有机磷农药降解菌液体种子，于25-37℃，通空气培养18-60h，得到活菌体培养物，菌体浓度达到60亿CFU/mL以上。
5、菌剂制备：培养好的发酵液经细菌计数后，加入甘氨酸(质量分数0.2%-2%)和甘油(质量分数0.2%-5%)，灌装保藏。使用时用水稀释500-1000倍。
由本发明技术方案生产的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)能够有效降解作物表面残留的有机磷农药，促进作物生长，而且生产成本低廉，还实现了高浓度有机废水的资源化。以下通过具体实施例详细说明本发明的实施，目的在于帮助读者更好地理解本发明的精神实质，但不作为对本发明实施范围的限定。
