申请日2004.06.07
公开(公告)日2009.05.20
IPC分类号G01N21/31; G01N1/34; G01N21/78
摘要
本发明属于微生物活性测定技术领域，特别涉及废水生物处理过程中污泥脱氢酶活性的测定方法。包括常规的样品制备、标准曲线制作和样品测定三个工作过程，在标准曲线制作过程中用的还原剂是10-20%的Na2S·9H2O溶液;样品测定操作过程中，对按常规方法配置的混合液进行培养、终止后，再进行分离处理加入丙酮提取TF，然后混匀比色。与现有技术比较，本发明方法的标准曲线制作步骤简单，还原生成的TF经过24小时后基本不褪色，增强了生成的TF的稳定性，提高准确性;在样品测定过程中以37℃常温萃取TF代替90℃高温萃取，避免了丙酮在高温下极易挥发的缺点，有利于提高脱氢酶活性检测分析方法的可靠性。本发明方法可用于废水生物处理中的好氧和厌氧污泥的脱氢酶活性测定。
权利要求书
1.一种污泥脱氢酶活性测定方法，包括常规的样品制备、标准曲线制作和样品测定 三个工作过程，其中包括分别配制标准曲线制作过程中所用的不同浓度的1、3、5—氯 化三苯基四氮唑溶液、pH为7.5-8.5的Tris-HCl缓冲液;分别配制在样品测定过程中所 用的0.18-0.36%的Na2SO3溶液和0.4-0.8%的1、3、5—氯化三苯基四氮唑溶液，所述在标 准曲线制作过程中所用的还原剂是10-20%的Na2S·9H2O溶液，其操作步骤为(1)取三种 或三种以上不同浓度的1、3、5—氯化三苯基四氮唑溶液，分别按Tris-HCl缓冲液：1、 3、5—氯化三苯基四氮唑溶液：10-20%Na2S·9H2O还原剂=2：1：1的体积比依次加入试 样管中混匀;并另取一对照管，按Tris-HCl缓冲液：蒸馏水：10-20%Na2S·9H2O还原剂 =2：1：1的体积比依次加入管中混匀;(2)将以上所有试管置于37±1℃恒温摇床中 振摇20分钟以上;(3)分别在各试管中加入丙酮液，静置5分钟以上后，将溶液直接在 分光光度计上于485纳米处比色，并根据所得的吸光度与相应的三苯基甲臜浓度值绘制 标准曲线;在样品测定过程中，(4)在一试管中按照4：3：2：1的体积比依次加入制备 好的污泥液、pH为7.5-8.5的Tris-HCl缓冲液、0.18-0.36%Na2SO3溶液和0.4-0.8% 1、 3、5—氯化三苯基四氮唑溶液并混匀;(5)按常规方法将上述混合液进行培养、终止， 然后在转速为4000rpm以上的离心机内分离5分钟以上;(6)弃去上层澄清液后加入与 混合液体积相等的丙酮溶液，密闭于37±1℃恒温摇床中提取三苯基甲臜后，进行离心 分离;(7)在去除泥渣的上清三苯基甲臜液中加入蒸馏水，然后混匀比色，再以常规 程序根据标准曲线计算污泥的脱氢酶活性值，其特征在于，所述(3)中丙酮液的加入 量为原管中溶液体积的1.5倍;所述(7)中蒸馏水的加入量是上清三苯基甲臜液体积的 2/3。
说明书
污泥脱氢酶活性测定方法
技术领域：
本发明属于微生物活性测定技术领域，特别涉及废水生物处理过程中污泥脱氢酶活性 的测定方法。
背景技术：
废水生物处理过程中，由于脱氢酶活性能够有效地反映处理体系中污泥所含活性微生 物量及其对有机物的降解活性，因而脱氢酶活性测定成为监测废水生物处理一项十分有效 的方法。
通常污泥脱氢酶活性测定是根据微生物氧化呼吸机理设计的。即以TTC为最终受氢体， 不加外源基质以便检测内源呼吸的代谢活性，当内源代谢发生时，氧化基质脱氢还原TTC 转变为红色的TF，TF以结晶形式积存于细胞之内，因此欲检测内源代谢生化活性强度， 必须检测TF生成的速度，先用有机溶剂将TF结晶从细胞内抽提出来，然后才能进行比色 定量分析，最后再根据已知标准曲线计算出TTC还原为TF的量。
目前，国内外大多教科书和科技文献中常以“1、3、5—氯化三苯基四氮唑”(TTC) 还原法来测定污泥的脱氢酶活性。例如俞毓馨等编著的《环境工程微生物检验手册》(中 国环境科学出版社，1990，163～165页)提到一种利用TTC为最终电子受体，通过还原显 色来测定脱氢酶活性的方法。该方法包括样品制备、标准曲线制作和样品测定三部分。该 方法的标准曲线制作是使用连二亚硫酸钠来还原TTC生成红色三苯基甲臜(TF)。但实际 试验发现，所生成的TF稳定性极差，其颜色在40分钟后几乎全部消失，严重影响了标准 曲线的准确性;而且在样品测定过程中，所生成的TF需要在90℃高温下进行萃取，由于 丙酮在高温下极易挥发，致使测定结果精确度不高。由于以上缺点，导致了这一技术在实 际应用方面受到较多限制。
发明目的
本发明的目的在于提供一种可靠的污泥脱氢酶活性测定方法，以克服标准曲线制作中 TF迅速褪色及样品测试中需要高温萃取的缺点，从而提高污泥脱氢酶活性测定的精确度。
发明内容：
本发明的污泥脱氢酶活性测定方法，包括常规的样品制备、标准曲线制作和样品测定 三个工作过程，其中包括分别配制标准曲线制作过程中所用的不同浓度的TTC溶液、pH为 7.5-8.5的Tris-HCl缓冲液;分别配制在样品测定过程中所用的0.18-0.36%的Na2SO3溶液 和0.4-0.8%的TTC溶液，其特征在于，所述在标准曲线制作过程中所用的还原剂是10-20% 的Na2S·9H2O溶液，其操作步骤为(1)取三种或三种以上不同浓度的TTC溶液，分别按 Tris-HCl缓冲液：TTC溶液：10-20% Na2S·9H2O还原剂=2：1：1的体积比依次加入试样管 中混匀;并另取一对照管，按Tris-HCl缓冲液：蒸馏水：10-20% Na2S·9H2O还原剂=2：1： 1的体积比依次加入管中混匀;(2)将以上所有试管置于37±1℃恒温摇床中振摇20分钟 以上;(3)分别在各试管中加入丙酮液，其加入量为原管中溶液体积的1.5倍，静置5分 钟以上后，将溶液直接在分光光度计上于485纳米处比色，并根据所得的吸光度与相应的 TF浓度值绘制标准曲线;在样品测定过程中，(4)在一试管中按照4：3：2：1的体积比 依次加入制备好的污泥液、pH为7.5-8.5的Tris-HCl缓冲液、0.18-0.36% Na2SO3溶液和 0.4-0.8% TTC溶液并混匀;(5)按常规方法将上述混合液进行培养、终止，然后在转速 为4000rpm以上的离心机内分离5分钟以上;(6)弃去上层澄清液后加入与混合液体积 相等的丙酮溶液，密闭于37±1℃恒温摇床中提取TF后，进行离心分离;(7)在去除泥 渣的上清TF液中加入蒸馏水，然后混匀比色，其中蒸馏水的加入量是上清TF液体积的2/3， 再以常规程序根据标准曲线计算污泥的脱氢酶活性值。
在常规方法标准曲线制作过程中，由于TF共轭双键会被过剩的连二亚硫酸钠所破坏， 导致还原生成的TF很快消失，影响标准曲线的准确性。发明方法中，采用10-20% Na2S·9H2O 作为还原剂克服了上述缺点，而且加入丙酮有稳定TF的作用，使还原生成的TF经过24小 时后基本不褪色，提高了标准曲线的准确性。本发明方法样品测试过程中，采用先将培养 液离心分离后，再加入丙酮进行提取，相当于提取时的丙酮浓度从常规方法的50%提高到 100%，增强了提取效果，可使提取温度从90℃降到37℃，而且提取效果更佳。
与其他脱氢酶活性测定方法相比，本发明方法具有如下优越性：
1.与现有技术中利用连二亚硫酸钠为还原剂制作标准曲线的方法相比较，原方法在 40分钟后基本上全褪色，本发明方法的标准曲线不仅制作步骤简单，而且增强了生成的TF 的稳定性，大大提高的标准曲线的准确性。
2.本发明方法以常温(37℃)萃取TF代替高温(90℃)萃取，是脱氢酶活性测定研究中 的一项重大突破，避免了丙酮在高温下极易挥发的缺点，不但有利于提高脱氢酶活性检测 分析方法的可靠性，而且必将会对脱氢酶活性测定这一生化分析技术的广泛应用起到积极 的推动作用。
本发明方法可用于废水生物处理中的好氧和厌氧污泥的脱氢酶活性测定。
具体实施方式
以下结合实施例对本本发明所述的测定法作进一步的描述。
实施例1：测定活性污泥的脱氢酶酶活性
1、样品制备：取45ml活性污泥(取自实验室中一个序批式反应器，污泥浓度MLVSS =3g，进水COD=1000mg/L，DO=3mg/L，运行周期=4h，进水=10min，曝气=215min; 沉降=5min;出水=10min)于150ml锥形瓶中，用玻璃珠剧烈摇动5分钟将污泥打碎，离 心后弃上清液，再用蒸馏水补足，搅拌洗涤，反复三次。然后再用蒸馏水稀释至原体积， 用玻璃棒搅动，使污泥悬浮，备用。
2、标准曲线制作
①准确称取100mg已烘干的TTC于100ml的容量瓶中，定容配制得1毫克/毫升的TTC溶 液。
②分别向5只50毫升的容量瓶中依次移入1.0、2.0、3.0、4.0、5.0毫升的TTC溶液， 定容得到浓度分别为20、40、60、80、100毫克/升的TTC溶液。
③取5支带塞20ml试样管，按2ml、1ml和1ml分别加入Tris-HCl(pH=7.6)缓冲液、 不同浓度的TTC溶液和新配制的10% Na2S·9H2O后混匀，另取1支对照管，依次加入2ml Tris-HCl(pH=7.6)缓冲液、1ml蒸馏水和新配制的1ml 10% Na2S·9H2O混匀(摇匀反应20分 钟左右)。
④往各管中加入6ml的丙酮液，稳定5分钟。
⑤将上述溶液直接在紫外可见分光光度计上于485纳米处测其吸光度，绘制标准曲 线。
3、样品测定
采用本发明方法，对制备好的活性污泥样按如下步骤进行8次重复试验。
①加试剂：往离心管中依次加入4ml制备好的污泥液，3ml Tris-HCl缓冲液 (pH=7.6)，2ml 0.18% Na2SO3溶液和1ml 0.4% TTC溶液，摇匀。
②样品培养：将上述离心管置于37±1℃恒温箱水浴中培养30分钟。
③终止反应：将离心管取出，加入2滴浓硫酸终止反应。
④样品离心：在4000rpm离心5分钟，弃上层澄清液。
⑤样品提取：往离心管中加入10ml丙酮溶液，用玻璃棒搅拌使污泥分散均匀，盖上 盖子密闭振摇提取5分钟。
⑥显色液分离：提取后离心管在4000rpm转速下离心5分钟，将上层澄清液移入一具 塞试管中，并加入6.7ml的蒸馏水，盖紧盖子并摇匀。
⑦比色：将上述溶液在分光光度计中于485纳米波长处比色。
⑧根据标准曲线计算结果。
根据对本实施例所用污泥的测定数据，经计算其污泥脱氢酶活性的平均值为49.82 mgTF/gMLVSS·h，标准偏差为±2.192。可见，本发明方法的重复试验精度比较理想。
实施例2：测定产甲烷污泥脱氢酶酶活性
1、样品制备：取20ml产甲烷污泥(取自一个产甲烷UASB反应器，污泥浓度MLSS= 10g，进水COD=10000mg/L，HRT=10h)于150ml锥形瓶中，并加入20ml水稀释，用玻 璃珠剧烈摇动5分钟将污泥打碎，离心后弃上清液，再用蒸馏水补足，搅拌洗涤，反复三 次。然后再用蒸馏水稀释至原体积，用玻璃棒搅动，使污泥悬浮，备用。
2、标准曲线制作
①准确称取50mg已烘干的TTC于50ml的容量瓶中，定容配制得1毫克/毫升的TTC溶 液。
②分别向3只50毫升的容量瓶中依次移入1.0、3.0、5.0毫升的TTC溶液，定容得浓 度分加为20、60、100毫克/升的溶液。
③取3支带塞20ml试样管，按2ml、1ml和1ml分别加入Tris-HCl(pH=8.0)缓冲液、 不同浓度的TTC溶液和新配制的15% Na2S·9H2O，另取1支对照管，依次加入2ml Tris-HCl (pH=7.6)缓冲液、1ml蒸馏水和新配制的1ml 15% Na2S·9H2O()，摇匀反应20分钟。
④往各管中加入6ml的丙酮，稳定5分钟。
⑤将上述溶液直接在紫外可见分光光度计上于485纳米处测其吸光度，绘制标准曲 线。
3、样品测定
采用本发明方法，对制备好的产甲烷污泥样品进行6次重复试验，
①加试剂：往离心管中依次加入4ml制备好的污泥液，3ml Tris-HCl缓冲液 (pH=8.0)，2ml 0.25% Na2SO3溶液和1ml 0.6% TTC溶液，摇匀。
②样品培养：将上述离心管置于37±1℃恒温箱水浴中培养60分钟。
③终止反应：将离心管取出，加入2滴浓硫酸终止反应。
④样品离心：在4000rpm离心5分钟，弃上层澄清液。
⑤样品提取：往离心管中加入10ml丙酮溶液，用玻璃棒搅拌使污泥分散均匀，盖上 盖子密闭振摇提取5分钟。
⑥显色液分离：提取后离心管在4000rpm转速下离心5分钟，将上层澄清液移入一具 塞试管中，并加入6.7ml的蒸馏水，盖紧盖子并摇匀。
⑦比色：将上述溶液在分光光度计中于485纳米波长处比色。
⑧根据标准曲线计算结果。
根据对本实施例所用污泥的测定数据，经计算其污泥脱氢酶活性的平均值为22.33 mgTF/gMLVSS·h，标准偏差为±2.432。可见，本发明方法的重复试验精度比较理想。
实施例3：测定产氢污泥的脱氢酶酶活性
1、样品制备：取35ml产氢污泥(取自一个产氢UASB反应器，污泥浓度MLSS=6.3g， 进水COD=5000mg/L，HRT=18h)于250ml锥形瓶中，并加入30ml水稀释，用玻璃珠剧烈 摇动5分钟将污泥打碎，离心后弃上清液，再用蒸馏水补足，搅拌洗涤，反复三次。然后 再用蒸馏水稀释至原体积，用玻璃棒搅动，使污泥悬浮，备用。
2、标准曲线制作
①准确称取100mg已烘干的TTC于100ml的容量瓶中，定容配制得1毫克/毫升的TTC标 准液。
②分别向6只50毫升的容量瓶中依次移入1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0毫升的TTC 标准液，定容得浓度分加为20、40、60、80、100、120毫克/升的溶液。
③取若6支带塞20ml试管，按2ml、1ml和1ml分别加入Tris-HCl(pH=8.4)缓冲液、 不同浓度的TTC溶液和新配制的20% Na2S·9H2O，另取1支对照管，依次加入2ml Tris-HCl (pH=7.6)缓冲液、1ml蒸馏水和新配制的1ml 20% Na2S·9H2O，摇匀反应20分钟。
④往各管中加入6ml的丙酮，稳定5分钟。
⑤将上述溶液直接在紫外可见分光光度计上于485纳米处测其吸光度，绘制标准曲 线。
3、样品测定
采用本发明方法，对制备好产氢污泥悬浮液进行7次重复试验。
①加试剂：往离心管中依次加入4ml制备好的污泥液，3ml Tris-HCl缓冲液 (pH=8.4)，2ml 0.36% Na2SO3溶液和1ml 0.8% TTC溶液，摇匀。
②样品培养：将上述离心管置于37±1℃恒温箱水浴中培养90分钟。
③终止反应：将离心管取出，加入2滴浓硫酸终止反应。
④样品离心：在4000rpm离心5分钟，弃上层澄清液。
⑤样品提取：往离心管中加入10ml丙酮溶液，用玻璃棒搅拌使污泥分散均匀，盖上 盖子密闭振摇提取5分钟。
⑥显色液分离：提取后离心管在4000rpm转速下离心5分钟，将上层澄清液移入一具 塞试管中，并加入6.7ml的蒸馏水，盖紧盖子并摇匀。
⑦比色：将上述溶液在分光光度计中于485纳米波长处比色。
⑧根据标准曲线计算结果。
其测定结果的平均值为23.87mg TF/gMLVSS·h，标准偏差为±2.343。可见，本发明 方法的重复试验精度比较理想。
