申请日2004.06.30
公开(公告)日2005.03.16
IPC分类号C12N1/00; C02F3/34; C12N1/21; C12N1/15; C12N1/19
摘要
降解制药废水特效菌株，其构建方法是将白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)真核细胞、土著细菌XZ1原核细胞(Bacillus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)真核细胞，共三个亲株菌的两界细胞的原生质体进行融合，三亲基因在同一个细胞内重组整合，构建出基因工程特效菌。本发明由双亲跨界融合和三亲跨界融合两部分组成。特效菌株含有亲株2的基因DNA片段，不同于亲株2，也不同于亲株1和亲株3。特效菌株综合了三亲株优势，利于处理降解制药废水。原生质体融合不产生新基因，不存在基因污染问题。
权利要求书
1、降解制药废水特效菌株，其特征是以 亲株1白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)， 亲株2土著细菌XZ1(Bacillus)， 亲株3酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)真核细胞原生质体和原核细胞原生质体制备后融 合。先制备原生质体，并经离心后收集、缓冲液清洗后获得，然后进行二次融合。 第一次融合：等量的 亲株1白腐真菌的原生质体与 亲株2土著细菌XZ1细胞的原 生质体混合、并在聚乙二醇、CaCl2、蔗糖配制的诱导液中融合，经离心后收集 融合产物;第二次融合：上次得到的等量的菌落与 亲株3酿酒酵母细胞的原生质 体混合、在聚乙二醇、CaCl2、蔗糖配制的诱导液中融合，经离心后收集融合产 物、含蔗糖高渗缓冲液离心清洗后、分别涂布于SIM1链霉素Sm培养基、SIM2 制霉菌素Nt培养基、S IM3链霉素Sm+制霉菌素Nt的双抗培养基三种固体鉴别 培养基上，同时能在三种培养基上长出的菌落为三亲跨界融合的保存号为 CGMCC.1087的菌落。
2、降解制药废水特效菌株构建方法，其特征是由 亲株1白腐真菌 (Phanerochaete chrysosporium)， 亲株2土著细菌XZ1(Bacillus)， 亲株3酿 酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)真核细胞和原核细胞先进行原生质体的制 备：用蜗牛酶和溶菌酶分别脱去真菌和细菌细胞壁、生成原生质体并经离心收集、 缓冲液清洗后获得，然后进行二次融合，第一次融合：等量的 亲株1白腐真菌 PC和 亲株2土著细菌XZ1细胞的原生质体混合、并在聚乙二醇、CaCl2、蔗糖配 制的诱导液中融合，经离心后收集融合产物、高渗缓冲液离心清洗后;第二次融 合：上次得到的等量的Xhh和 亲株3酿酒酵母SC原生质体混合、在聚乙二醇、 CaCl2、蔗糖配制的诱导液中融合，经离心后收集融合产物、含蔗糖高渗缓冲液 离心清洗后、分别涂布于SIM1链霉素Sm培养基、SIM2制霉菌素Nt培养基、SIM3 链霉素Sm+制霉菌素Nt的双抗培养基三种固体鉴别培养基上，同时能在三种培 养基上长出的菌落为三亲跨界融合的保存号为CGMCC.1087的菌落。
3、由权利要求2所述的特效菌株构建方法，其特征是第一次融合原生质体 分别涂布于SIM1链霉素Sm培养基、SIM2制霉菌素Nt培养基、SIM3链霉素Sm+ 制霉菌素Nt的双抗培养基三种固体鉴别培养基上以30℃培养7天，同时能在三 种培养基上长出的菌落，为第一次双亲跨界融合的产物菌落;第一次双亲跨界融 合的产物菌落再进行第二次融合。
4、由权利要求3所述的特效菌株构建方法，其特征是所述抗生素为抗细菌 的抗生素和抗真菌的抗生素，即抗细菌的链霉素和抗真菌的制霉菌素，SIM1= SM+100u链霉素/ml，SIM2=SM+100u制霉菌素/ml，SIM3=SM+100u链霉素/ml +100u制霉菌素/ml。
5、由权利要求2所述的特效菌株构建方法，其特征是白腐真菌PC真核细胞 原生质体制备及条件：10,000rpm离心108细胞菌液10分钟，收集菌体、0.5 %蜗牛酶、30℃反应40分钟、10,000rpm离心收集原生质体、PH7.0缓冲液离 心清洗2遍。
6、由权利要求2所述的特效菌株构建方法，其特征是以制药废水土著细菌 XZ1(Bacillus)属于杆菌属，土著细菌XZ1原生质体制备及条件：10,000rpm 离心108细胞菌液10分钟，收集菌体细胞、0.5%溶菌酶、30℃反应40分钟、 10,000rpm离心收集原生质体、PH7.0缓冲液离心清洗2遍。
7、由权利要求2所述的特效菌株构建方法，其特征是聚乙二醇和Ca2+诱导 PC与XZ1双亲跨界融合：35%的聚乙二醇、20mmol的CaCl2、蔗糖17%、30℃ 诱导融合30分钟，并经双亲首次跨界融合产物Xhh初筛：10,000rpm离心10 分钟收融合产物Xhh、PH7.0、蔗糖17%高渗缓冲液、离心清洗2遍、分别涂布 于SIM1链霉素Sm培养基、SIM2制霉菌素Nt培养基、SIM3链霉素Sm+制霉菌 素Nt的双抗培养基三种固体鉴别培养基上、30℃培养7天，同时能在三种培养 基上长出的菌落为Xhh。
8、由权利要求7所述的特效菌株构建方法，其特征是先制备菌落原生质体 和SC原生质体，经聚乙二醇和Ca2+诱导：Xhh与SC的三亲株跨界融合：等量混 合菌落与SC原生质体，第二次跨界融合三亲产物的菌落初筛，能在SIM3双抗培 养基的有三亲跨界融合的菌落和双亲跨界融合的菌落。
说明书
降解合成制药有机废水的特效菌株及构建方法
技术领域
本发明涉及一种特效菌株及其构建方法，尤其是一种用于降解合成制药废水 微生物新菌种的生物构建和应用技术，更具体而言是两真菌与一细菌原生质体融 合的特效菌株及其构建方法。
背景技术
就原生质体融合生物技术而言，国际上已有种种原生质体融合专利，如用于 选择抗生素的菌种，如Imada C，Isolation and characterization of the interspecific fusants from Streptomycetes obtained using a liquor regeneration method， FISHERIES SCI，68(2)：395-402，2002(从链霉素中使用液态重构方法得到的中间 体产物的分离和特征);和Baltz RH，Genetic methods and strategies for secondary metabolite yield improvement in antinomycetes，ANTON TEEUW INT J G 79(3-4)：251-259，2001(从抗生素中得到第二代谢物质的遗传方法)。但未见有专 用于处理较高浓度的有机废水的三种微生物原生质体融合菌种和构建方法的专 利，尤其是未见真核原核两界菌株原生质体融合的构建菌种技术，尤其是用于处 理较高浓度的制药有机废水。如某公司合成生产神经调节类药物，废水中含有机 氯及其它苯环与杂环化等有机污染物，其中持久性有机污染物POPs(persistent organic pollutants)及环境激素EH(environmental hormone)类污染物多达 16种以上。它们难以被土著微生物快速降解，对人类存在着致癌症和降低精子 数量与质量的分子遗传毒性，对环境潜在着破坏生物多样性的分子生态毒性。
发明内容
本发明目的是：用真核和原核两界微生物菌株原生质体融合的菌种构建新 菌株，将三个菌株的基因和优势，通过体内重组与整合，构建在一个菌株细胞 内，用于废水处理，尤其是用于处理较高浓度的有机废水，特别是合成制药企 业的有机废水。
一种特效菌株及其构建方法， 亲株1白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)真核细胞， 亲株2土著细菌XZ1(Bacillus)原核细胞，亲株3 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)真核细胞中，2个真菌亲株的真核细胞原 生质体制备是用蜗牛酶脱去细胞壁及1个细菌亲株的原核细胞原生质体是用溶 菌酶脱去细胞壁，制备生成的原生质体经离心收集、缓冲液清洗后获得，然后进 行二次融合。第一次融合：等量的 亲株1白腐真菌细胞和 亲株2土著细菌XZ1 细胞的原生质体混合、并在聚乙二醇(PEG，MW=6000)、和CaCl2、蔗糖配配制的 诱导液中融合，经离心后收集融合产物、高渗缓冲液离心清洗后分别涂布于 SIM1、SIM2、SIM3三种固体鉴别培养基上、30℃培养7天，同时能在三种培 养基上长出的菌落，为第一次双亲跨界融合的产物Xhh;而 亲株1白腐真菌细胞 细胞和 亲株2土著细菌XZ1细胞，只能分别在SIM1和SIM2上生长;第二次融合： 上次得到的等量的Xhh和 亲株3酿酒酵母细胞的原生质体混合、在聚乙二醇(PEG， MW=6000)、和CaCl2、蔗糖配配制的诱导液中融合，经离心后收集融合产物、含 蔗糖高渗缓冲液离心清洗后、分别涂布于SIM1、SIM2、SIM3三种固体鉴别培 养基上，同时能在三种培养基上长出的菌落为三亲跨界融合的产物NJU-Xhhh1 或Xhh。所述三种培养基上长出的菌落为三亲跨界融合的保存号为CGMCC.1087。
所述固体鉴别培养基(SIM)为单一抗细菌的抗生素[SIM1=SM(固体基础培 养基)+100u链霉素/ml(streptomycin，Sm)]和单一抗真菌的抗生素[SIM2= SM+100u制霉菌素/ml(nystatin，Nt)]以及二种抗生菌同时存在的组合[SIM3= SM+100u链霉素/ml+100u制霉菌素/ml(Sm+Nt)]
发明的有益效果：
(1)融合构建NJU-Xhhh1特效菌的成本，低于分子克隆，费用在10万元人 民币以内;
(2)原生质体融合菌株的遗传性能稳定、重现性好，同时含有三亲株DNA 的功能优势;
(3)原生质体融合技术操作较分子克隆简便，可以省去建立基因图谱等操作;
(4)原生质体融合是自然基因在细胞内重组，没有创造新基因，不存在基 因污染问题。
总之，本发明是两界三个亲株微生物原生质体融合的原创性的生物技术。是 应用两界三亲菌株原生质体融合技术构建特效菌处理废水的首例。本发明 亲株1 白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)具有高降解性， 亲株2土著细菌XZ1 (Bacillus)具有高适应性， 亲株3酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具 有高絮凝性。融合三亲菌株，通过基因在同一个细胞内的重组整合，获得了特效 菌NJU-Xhhh1，集中了三个亲株的高降解性、高适应性、高絮凝性的三高优势， 利于高效处理有机废水。使用效果：NJU-Xhhh1降解制药废水的比降解率为 0.2222d-1，是土著菌的2.2倍。提高处理效率和节约费用25%以上;本发明特效 菌剂既可处理有毒有机废水，也可处理常规有机废水;本发明特效菌剂应用原 生质体融合工程菌，不产生新基因，没有基因污染问题。降解合成制药废水具有 高降解、高适应、高絮凝优势。
