申请日2004.05.24
公开(公告)日2005.02.23
IPC分类号C12Q1/68
摘要
一种分析城市污水厂污泥微生物群落构成的方法，涉及PCR-DGGE技术对城市污水厂污泥微生物群落构成的分析方法。包括第一步DNA提取;第二步PCR扩增;第三步PCR产物浓缩;第四步DGGE电泳分离得DGGE图谱。其特点是：第一步DNA提取分两次直接得到总DNA。先取2～5g污泥样品，用DNA提取液等对污泥进行DNA提取后，沉淀中再加入DNA提取液等离心收集上清液，合并上次上清，再在上清液中加入由氯仿和异戊醇组成的混合液，离心，取上层水层，重复上步操作离心，合并水层，完成DNA提取。第四步，DGGE使用变性梯度为30%～60%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后得反映城市污水厂污泥微生物群落构成的DGGE图谱。本发明省时省力、简捷准确、成本低。可广泛应用于各类城市污水厂污泥微生物群落构成的分析。
権利要求書
1.一种分析城市污水厂污泥微生物群落构成的方法，包括第一步DNA提 取;
第二步PCR扩增：在提取的DNA中加入引物和反应体系，PCR扩增程序为： 起始94℃预变性5min;94℃变性45s，60℃引物复性45s，72℃引物延伸90s， 30个循环;72℃终延伸20min，产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测产物，电泳缓 冲液为0.5×TBE缓冲液;
第三步PCR产物浓缩：合并数管PCR扩增后产物，用Parafilm膜封口，置 于-70℃冰箱冷冻过夜保存，取出后用冷冻抽干机浓缩处理4小时，将得到的干 粉溶解于30μl pH为7.6的TE缓冲液中;第四步DGGE电泳分离得DGGE图 谱，其特征在于：
第一步DNA提取是分两次直接提取污泥的总DNA的，首先称取2～5g污 泥样品，用13.5-27ml的DNA提取液、40-60μL20mg/mL溶菌酶和1.5mL 20%SDS，65℃度水浴2小时，每隔15-20分钟轻摇几下，离心收集上清液置于 离心管中，沉淀中再加入4.5mL DNA提取液和0.5mL 20%的SDS，离心收集上 清液合并于上次上清，在上清液中加入等体积的由氯仿和异戊醇按24∶1体积比 组成的混合液，离心10min，取上层水层于另一离心管中;在沉淀中重复上步操 作：加入氯仿异戊醇混合液后离心，合并水层，加入0.6倍体积的异丙醇，室温 放置1h，9000r/min离心20min，收集沉淀溶解于500μL pH为7.6的TE缓冲 液中;
第四步，DGGE电泳分离：首先制备变性梯度为30%～60%的聚丙烯酰胺凝 胶，然后使用电泳缓冲液为1×TAE，电压150V，60℃，电泳4～8h，溴乙锭染 色20～40min，得DGGE图谱。
说明书
一种分析城市污水厂污泥微生物群落构成的方法
技术领域
本发明涉及一种使用聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术对 城市污水厂污泥中微生物群落构成的分析方法，属于微生物生态学领域。
背景技术
城市污水厂污泥是由多种微生物形成的菌胶团与吸附其上的有机物和无机 物组成的集合体，含有大量的细菌、病毒、原生动物、寄生虫卵及其他的微生物， 微生物多样性丰富，微生物群落构成复杂。分析城市污水厂污泥中微生物群落构 成具有十分重大的学术价值和实际应用前景：既可通过分析获得污泥中微生物种 群结构的时空动态变化，判断和预测污泥生态系统的功能变化趋势;又可根据污 泥生态系统中微生物群落构成和特定种群的动态变化，监测和调控污泥处理处置 工艺的运行情况，从而对工艺运行和控制起正确的指导作用。
过去对污泥中微生物的研究多采用传统的培养方法，采用分类和鉴定，主要 是根据微生物的个体形态、培养特征和生理生化等特征，运用平板计数法、镜检 法等进行环境生物学的研究。但是这种传统方法存在很多不足：不能反映成分复 杂的城市污水厂污泥样品中微生物的真实情况;难以获得微生物群落结构和空间 分布的有关信息等;且纯培养方法和原理大多从医药微生物学引进，对成分复杂 的城市污水厂污泥样并不很适合(譬如在自然生态环境下许多微生物处于贫营 养，而在实验室用营养丰富的牛肉汁蛋白胨来测定样品中活细菌的总数，大量的 贫营养微生物不适宜生长，造成测定结果误差大);一般实验室在分离培养细菌 时通常只是在28℃下培养，而污泥中除了存在中、高温型细菌，还有低温型细 菌，此时低温型细菌则被忽视了。
近几年，对废水和土壤中的微生物种群动态分析采用了逐步发展起来的现代 分子生物技术，尤其是基于16S r DNA基因序列多态性分析技术，因为该技术 可有效避免传统培养、分离中的筛选和富集作用所造成的微生物多样性丢失， 群构成变化等问题，并能更为直接可靠地反映样品中微生物多样性及种群分布情 况，且现代分子生物技术较传统培养、分离和鉴定也更为简易、快速和准确。这 些方法包括限制性片断长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性(RAPD)、扩增片 断长度多态性(AFLP)、核酸杂交技术、荧光原位杂交(FISH)和变性梯度凝 胶电泳(DGGE)等。其中变性梯度凝胶电泳(DGGE)因稳定性和重复性好， 灵敏度高，能提供群落中优势种群信息和可同时分析多个样品等优点而被实际应 用于对废水和土壤中的微生物种群动态分析。
中科院生态环境研究中心运用PCR-DGGE技术对农田土壤微生物群落研究进 行引物设计并申请了中国专利“一种PCR-DGGE研究环境微生物群落的引物设 计方案”(公开号CN1456684A)。
然而城市污水厂污泥和农田土壤的化学、物理性质高度异质，微生物数量和 种群分布也明显不同，这就决定了两种环境样品在进行微生物群落构成分析时存 在差异。目前国内外尚无关于运用PCR-DGGE技术进行城市污水厂污泥微生物 群落构成研究的相关报道。因为城市污水厂污泥成分复杂、微生物多样性丰富。
发明内容
本发明的目的是公开一种分析城市污水厂污泥微生物群落构成的方法。本发 明进一步的目的是将PCR-DGGE技术应用于分析成分复杂的城市污水厂污泥微 生物群落构成。
为达到上述目的，本发明根据城市污水厂污泥特性，结合土壤样品微生物多 样性研究方法，摸索出一种适用于城市污水厂污泥中微生物种群构成的分析方 法。可以不经过纯培养直接提取城市污水厂污泥样品中微生物的总基因组DNA， 因为DNA分子的种类及各分子的相对比例反映了污泥样品中微生物种群的种类 数量和种群间的相对比例，在得到的DGGE图谱中，每一条带可以是来自若干 种不同微生物的基因组DNA片断组成，条带的数目反映该种群微生物种群数量 的高低，这样，城市污水厂污泥微生物群落的结构信息，就被间接地记录于DGGE 图谱上。因此，分析DGGE图谱就可分析污泥微生物的群落构成。具体步骤包 括第一步DNA提取、第二步PCR扩增：先在提取的DNA模板中加入引物、Taq 酶、缓冲液和dNTP，然后控制起始94℃预变性5min;94℃变性45s，60℃引物 复性45s，72℃引物延伸90s，30个循环;72℃终延伸20min。产物用1%的琼 脂糖凝胶电泳检测产物，电泳缓冲液为0.5×TBE缓冲液。第三步PCR产物浓缩： 合并数管PCR扩增后产物，用Parafilm膜封口，置于-70℃冰箱冷冻过夜保存， 取出后用冷冻抽干机浓缩处理4小时，将得到的干粉溶解于30μl pH为7.6的 TE缓冲液中。第四步DGGE电泳分离得DGGE图谱，其特点是：
第一步是分两次直接提取污泥的总DNA，首先称取2～5g污泥样品，用 13.5-27ml的DNA提取液、40-60μL20mg/mL溶菌酶和1.5mL 20%活性剂SDS， 65℃度水浴2小时，每隔15-20分钟轻摇几下，离心收集上清液置于离心管中， 沉淀中再加入4.5mL DNA提取液和0.5mL 20%的SDS，离心收集上清液合并于 上次上清液。在上清液中加入等体积的氯仿∶异戊醇=24∶1(体积比)混合液， 离心10min，取上层水层于另一离心管中。在上层水层中重复上步操作加入氯仿 -异戊醇混合液后离心，合并水层，用占水层0.6倍体积的异丙醇，室温放置 1h，9000r/min离心20min，收集沉淀溶解于500μL pH为7.6的TE缓冲液中。
第四步，DGGE电泳分离：首先制备聚丙烯酰胺变性梯度凝胶，使其变性梯 度为30%～60%。然后使用电泳缓冲液为1×TAE，电压150V，60℃，电泳4～8h， 溴乙锭染色20～40min。得DGGE图谱，
本发明的优点如下：
1.由于本发明直接提取城市污水厂污泥样品中的总DNA，避免了在传统培 养过程中的筛选和富集作用，能更直接真实地反应污泥样品中的微生物多样性及 种群分布情况，较传统培养、分离和鉴定也更为简易、准确。
2.由于本发明所采用的在DNA提取中重复氯仿-异戊醇抽提步骤，以进一 步纯化DNA，减少污泥中的腐殖酸质、有机分子等杂质对核酸提取和PCR反应 过程的抑制作用。因此首次将PCR-DGGE应用于成分复杂的污泥样品微生物种 群动态的分析。与传统方法的一个多星期才出结果比较，节省了大量的时间(只 需两天即可完成)和财力，且避免了传统方法菌种培养和筛选时微生物信息的缺 失。
3.由于本发明减少了样品的取样量，仅为传统取样量的1/5，使含水率低， 样品松散的城市污水厂污泥能与加入样品中的缓冲溶液不形成粘度很大的泥，使 之后加入的溶菌酶和活性剂SDS混合均匀，导致本发明工艺简单易行。
4.本发明无需昂贵的操作试剂盒，成本低，用本发明的方法可同时分析多 个城市污水厂污泥微生物种群结构，获得其空间动态变化，以及为城市污水厂污 泥处理工艺的运行改良提供很好的指导和评价作用。
5.本发明应用范围广，适于城市污水厂污泥及经各种处理处置工艺后污泥， 可针对污泥处理工艺不同运行阶段的污泥样品进行DGGE分析，从而为工艺运行 稳定性提供指导和评价。同时可针对不同种群菌种进行分析，确定优势菌种并进 而研究菌种功能性，为科研和工艺改良提供新的思路和依据。
