申请日2019.04.09
公开(公告)日2019.05.28
IPC分类号C12N7/00
摘要
本发明公开了一种从好氧颗粒污泥中高效提取富集噬菌体的方法。该方法按照以下步骤进行：(1)污泥研磨;(2)胞外多聚物水解;(3)超声/涡旋震荡(4)上清液提取;(5)二级超滤浓缩;(6)样品保存固定。该方法操作简便，反应条件温和，无有毒试剂使用，可有效解决颗粒污泥体系由于EPS包裹产生的提取效率低下，细菌胞溶导致的宿主DNA污染等问题，是一种高效可行的噬菌体提取方法。相比于传统使用PEG和盐析结合提纯噬菌体的方法相比，无需使用PEG和NaCl等药剂，提纯时间有原来24h缩短至6h左右，且所得样品盐浓度低，无需进一步透析除盐，所得的浓缩液可直接用于透射电镜，DNA提取，CsCl2梯度离心等相关操作。
权利要求书
1.一种从活性污泥中提取富集噬菌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：使用细胞研磨器研磨污泥样品，使污泥样品分散;
步骤2：对步骤1处理后的样品利用糖化水解酶进一步水解，去除污泥样品中的EPS，降低EPS对噬菌体释放的影响;
步骤3：对步骤2处理后的样品采用超声和涡旋震荡交替进行的方式，将附着在污泥细菌表面的噬菌体分散到液相中;
步骤4：对步骤3处理后的样品进行离心分离，取离心后的上清液过0.22μm无菌滤膜，去除游离细菌;
步骤5：对步骤4得到的滤液利用DNA降解酶Dnase I去除宿主菌污染;
步骤6：对步骤5处理后的滤液，利用50kDa的超滤离心管进行一级超滤浓缩;然后采用30kDa超滤管对一级超滤浓缩液进行二级超滤浓缩，得到噬菌体富集液;
步骤7：对最终富集液根据后续用途进行保存固定。
2.如权利要求1所述的从活性污泥中提取富集噬菌体的方法，其特征在于，步骤1中，污泥样品在研磨前，需取污泥样品测定其MLVSS，作为生物量的基本指标。
3.如权利要求1所述的从活性污泥中提取富集噬菌体的方法，其特征在于，步骤3中，超声和涡旋震荡交替重复十轮;每轮超声时间为2min，旋涡震荡时间为10s，超声和旋涡震荡时间间隔为2s，超声功率为25W。
4.如权利要求1所述的从活性污泥中提取富集噬菌体的方法，其特征在于，步骤4中，离心分离时离心机转速为3000rpm，离心时间为30分钟。
5.如权利要求1所述的从活性污泥中提取富集噬菌体的方法，其特征在于，步骤5中，滤液中添加的Dnase I浓度为2000U/L，酶解反应时间为3h。
6.如权利要求1所述的从活性污泥中提取富集噬菌体的方法，其特征在于，步骤6中，进行一级超滤浓缩时，先将步骤5处理后的滤液定量转移至50kDa的超滤离心管中，离心后弃去下管中的上清液，然后再重新转入等量的滤液继续离心，直至滤液全部超滤离心完毕;滤液在一级超滤浓缩后，浓缩比不超过50：1。
7.如权利要求1所述的从活性污泥中提取富集噬菌体的方法，其特征在于，步骤6中，一级超滤浓缩过程中，采用逐级提速的方法保证过滤压差，转速从3000rpm逐渐提升至3500rpm;二级超滤浓缩的转速为10000rpm。
8.如权利要求1所述的从活性污泥中提取富集噬菌体的方法，其特征在于，步骤6中，一级超滤浓缩后的浓缩液可在超滤管中重新稀释，震荡混匀后重复进行若干次一级超滤浓缩，然后再进行二级超滤浓缩。
9.如权利要求1所述的从活性污泥中提取富集噬菌体的方法，其特征在于，步骤7中，所述噬菌体富集液用于细胞实验，其保存固定方法为：向噬菌体富集液中添加甘油，至甘油含量为20vt.%，于4℃下保持活性。
10.如权利要求1所述的从活性污泥中提取富集噬菌体的方法，其特征在于，步骤7中，所述噬菌体富集液用于分子测序，其保存固定方法为：向噬菌体富集液中添加戊二醛，至戊二醛含量为0.5vt.%，于液氮中急冻，可保存一年以上。
说明书
一种从活性污泥中提取富集噬菌体的方法
技术领域
本发明涉及一种从活性污泥中提取噬菌体的方法，属于废水生物处理领域。
背景技术
噬菌体是细菌病毒的一种，是目前已知自然环境中丰度最大的生物体。烈性噬菌体通过吸附，注入，整合，装配，裂解五个步骤对宿主细菌完成捕食。近年来噬菌体逐渐应用于病原菌检测，细菌疾病控制，管道生物膜抑制方面，显示出巨大的潜力。活性污泥中噬菌体丰度可达自然水体噬菌体丰度的100-1000倍，具有巨大的资源潜力。然而，活性污泥是由复杂菌群以及胞外分泌物组成生物聚集体，其在污泥体系中的存在形式多样，与宿主菌的作用机制极为复杂，目前，未有可靠的方法能够高效地提取并富集污泥中的噬菌体。因此，研究高效稳定的噬菌体提取方法并建立评价体系是进一步发掘活性污泥生物资源，促进噬菌体研究与应用的重要保证。
发明内容
本发明的目的是提供一种从活性污泥中高效提取富集噬菌体的方法，通过酶解-超声-超滤等一系列操作，保证污泥提取效率的同时有效降低宿主DNA的污染,并设计不同的保存手段，以满足后续实验的多样要求。
本发明具体采用的技术方案如下：
一种从活性污泥中提取富集噬菌体的方法，它包括以下步骤：
步骤1：使用细胞研磨器研磨污泥样品，使污泥样品分散;
步骤2：对步骤1处理后的样品利用糖化水解酶进一步水解，去除污泥样品中的EPS，降低EPS对噬菌体释放的影响;
步骤3：对步骤2处理后的样品采用超声和涡旋震荡交替进行的方式，将附着在污泥细菌表面的噬菌体分散到液相中;
步骤4：对步骤3处理后的样品进行离心分离，取离心后的上清液过0.22μm无菌滤膜，去除游离细菌;
步骤5：对步骤4得到的滤液利用DNA降解酶Dnase I去除宿主菌污染;步骤6：对步骤5处理后的滤液，利用50kDa的超滤离心管进行一级超滤浓缩;然后采用30kDa超滤管对一级超滤浓缩液进行二级超滤浓缩，得到噬菌体富集液;
步骤7：对最终富集液根据后续用途进行保存固定。
基于上述方案，各步骤中的参数以及材料可以采用如下优选方案：
优选的，步骤1中，污泥样品在研磨前，需取污泥样品测定其MLVSS，作为生物量的基本指标。
优选的，步骤3中，超声和涡旋震荡交替重复十轮，每轮超声时间为2min，旋涡震荡时间为10s，超声和旋涡震荡时间间隔为2s，超声功率为25W。
优选的，步骤4中，离心分离时离心机转速为3000rpm，离心时间为30分钟。
优选的，步骤5中，滤液中添加的Dnase I浓度为2000U/L，酶解反应时间为3h。
优选的，步骤6中，进行一级超滤浓缩时，先将步骤5处理后的滤液定量转移至50kDa的超滤离心管中，离心后弃去下管中的上清液，然后再重新转入等量的滤液继续离心，直至滤液全部超滤离心完毕。
优选的，步骤6中，一级超滤浓缩过程中，采用逐级提速的方法保证过滤压差，转速从3000rpm逐渐提升至3500rpm;二次超滤浓缩的转速为10000rpm。
优选的，步骤6中，滤液在一级超滤浓缩后，浓缩比不超过50：1。
优选的，步骤6中，当原始样本中组分较为复杂时，一级超滤浓缩后的浓缩液可在超滤管中重新稀释，震荡混匀后重复进行若干次一级超滤浓缩，然后再进行二级超滤浓缩。进一步优选为，将所得浓缩液用PBS超纯水稀释至10-15ml,重复进行进行一级超滤过程。
优选的，步骤7中，所述噬菌体富集液用于细胞实验，其保存固定方法为：向噬菌体富集液中添加甘油，至甘油含量为20wt.%，于4℃下保持活性。
优选的，步骤7中，所述噬菌体富集液用于分子测序，其保存固定方法为：向噬菌体富集液中添加戊二醛，至戊二醛含量为0.5wt.%，于液氮中急冻，可保存一年以上。
本发明的有益效果：
由于本发明采用了多种高效酶和膜材料过滤方法，使得化学试剂用量大大减少，操作时间短，反应条件温和，无有毒试剂使用，可有效解决颗粒污泥体系由于EPS包裹产生的提取效率低下，细菌胞溶导致的宿主DNA污染等问题，是一种高效可行的噬菌体提取方法。
