申请日20200309
公开(公告)日20200417
IPC分类号C02F9/02; C07K14/415; C07K1/14; C07K1/34; C12P21/06; C02F103/32
摘要
本发明公开了一种从豌豆豆清废水中提取抗菌肽及白蛋白的方法，以豌豆蛋白加工过程中产生的豌豆豆清废水为原料，在提取白蛋白时，进行离心分离后，通过控温换热调节原料温度，然后依次经过微滤、纳滤、超滤、二级纳滤步骤，得到白蛋白浆液;将白蛋白浆液经过多效浓缩后，添加碱性物质调节pH，再经过杀菌和干燥，最终得到白蛋白，实现了对豌豆豆清废水中小分子量的白蛋白的针对性提取，避免了资源浪费。有效回收了豌豆豆清水中的小分子量的白蛋白和抗菌肽，避免对豌豆豆清水处理不当造成的环境污染，实现资源再利用。
权利要求书
1.一种从豌豆豆清废水中提取抗菌肽的方法，其特征在于，以豌豆蛋白加工过程中产生的豌豆豆清废水为原料，进行离心分离后，通过控温换热调节原料温度，然后依次经过微滤、纳滤、超滤、二级纳滤步骤，得到白蛋白浆液;将白蛋白浆液经过多效浓缩后，添加碱性物质调节pH，再经过杀菌和干燥，得到白蛋白;
将白蛋白加水得到白蛋白浆液之后，进行水浴预处理，冷却后放在恒温磁力搅拌器上搅拌，随后加入木瓜蛋白酶，滴加碱溶液保持酶解液pH不变;充分酶解后，煮沸灭酶，冷却后调节pH 至7.0;离心，上清液进行旋转蒸发浓缩，采用0.22μm的针头式滤膜除菌，得到抗菌肽初产物;
将抗菌肽初产物通过萃取器，该萃取器预先用甲醇水溶液清洗并活化然后用三氟乙酸水溶液清洗并平衡;依次使甲醇水溶液和三氟乙酸水溶液通过上述萃取器并收集穿透液，将穿透液采用旋转蒸发仪真空浓缩，取出抗菌肽浓缩液于-15℃冷冻，然后将结冰的抗菌肽置于真空冷冻干燥机中进行干燥，得到纯化后的抗菌肽;
所述抗菌肽具有如下特征：利用酸度计测定抗菌肽的PH值为2.56-2.78;
所述抗菌肽分子中含有：甘氨酸、半胱氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、谷氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、酪氨酸。
2.一种从豌豆豆清废水中提取白蛋白的方法，其特征在于，以豌豆蛋白加工过程中产生的豌豆豆清废水为原料，进行离心分离后，通过控温换热调节原料温度，然后依次经过微滤、纳滤、超滤、二级纳滤步骤，得到白蛋白浆液;将白蛋白浆液经过多效浓缩后，添加碱性物质调节pH，再经过杀菌和干燥，得到白蛋白。
3.如权利要求2所述的从豌豆豆清废水中提取白蛋白的方法，其特征在于，具体步骤为：
1)离心分离：以豌豆豆清废水为原料，进行离心分离;
2)控温换热：将离心分离后得到的豆清水进行换热处理;
3)微滤：将换热处理后的豆清水进行微滤处理;
4)纳滤：采用纳滤模组，调节系统压力以及过滤温度，去除93%-95%的水分;
5)超滤：采用超滤膜，经过5-10次洗脱分离，得到粗品白蛋白浆液;
6)二级纳滤：选用抗污染纳滤膜，加入清水洗涤粗品白蛋白，洗涤完成后去除用于洗涤的清水;
7)多效浓缩：将洗涤好的白蛋白浆液，加入到蒸发器中进行蒸发浓缩;
8)中和：在不锈钢罐内添加碱性物质，调节pH;
9)杀菌、干燥。
4.如权利要求2或3所述的从豌豆豆清废水中提取白蛋白的方法，其特征在于，所述控温换热时的温度为40-50℃。
5.如权利要求2或3所述的从豌豆豆清废水中提取白蛋白的方法，其特征在于，所述微滤过程中采用的膜是碳化硅膜或陶瓷膜。
6.如权利要求5所述的从豌豆豆清废水中提取白蛋白的方法，其特征在于，所述碳化硅膜的孔径为10纳米-30微米。
7.如权利要求2或3所述的从豌豆豆清废水中提取白蛋白的方法，其特征在于，所述纳滤过程中，调节系统压力为18-25bar ，过滤温度为40-65℃。
8.如权利要求2或3所述的从豌豆豆清废水中提取白蛋白的方法，其特征在于，所述超滤过程中，采用孔径可隔离分子量为1000-5000道尔顿的超滤膜。
9.权利要求3所述的从豌豆豆清废水中提取白蛋白的方法，其特征在于，所述二级纳滤过程中，用于洗涤的清水为步骤4)中纳滤后得到的93%-95%的清水。
10.如权利要求2或3所述的从豌豆豆清废水中提取白蛋白的方法，其特征在于，所述多效浓缩过程中，蒸汽压力为0.6～0.8Mpa;浓缩后的出料浓度为 25%-50%;所述中和过程中，在温度为40-65℃条件下，向体系内加入碱性物质，调节pH值至6.5-8。
说明书
一种从豌豆豆清废水中提取抗菌肽及白蛋白的方法
技术领域
本发明属于蛋白质提取技术领域，具体涉及一种从豌豆豆清废水中提取抗菌肽及白蛋白的方法。
背景技术
豌豆作为高淀粉含量的作物，常用作粉丝和粉条的原料。豌豆豆清废水是生产豌豆分离蛋白过程中产生的废水,每生产1吨分离蛋白会排放25-35立方的豆清废水,国内豌豆分离蛋白生产企业每年产生的豌豆豆清为1300万吨以上，数量较大。
豆清废水含有较高的氨氮和COD，氨氮高达700;COD(化学耗氧量)、BOB(生物耗氧量)值很高,均10000以上，通常处理的时候需要填加大量的絮凝剂，例如聚丙烯酰胺和聚合氯化铝等，经过气浮絮凝出来，再经过板框压滤机去除水分，作为固体废料;或者是处理后销售作为饲料或发酵工业原料，但是上述处理方式技术附加值低，产物能够带来的经济效益低，造成资源的浪费，同时由于添加了大量的絮凝剂，存在安全风险和安全隐患。
目前有一种处理豌豆豆清废水的方式，即回收分离蛋白，采用等电点酸沉;但是在回收豌豆分离蛋白后，残留的豌豆乳清废水仍含有分子量较小的蛋白质组分存在于其中，不能被有效提取利用。
豆清中小分子量的蛋白质具有提高免疫力、抗氧化等作用,可提取应用为保健食品的原料，具有很高的营养和利用价值，如果不能对此进行有效提取，不仅使得豌豆乳清蛋白浪费，造成白蛋白的损失，也会造成环境污染。
但是，豌豆豆清蛋白本身的物理性质使得有效回收分子量小的白蛋白仍存在一定困难。国内对于豌豆豆清蛋白的回收处理方法研究较少，现有技术中有采用酶解技术制备提取豌豆蛋白多肽的，首先制备的目标的产物不同，其次如果将酶解技术应用到从豌豆豆清蛋白中提取白蛋白，则会导致蛋白质产生苦味，影响口感，其次，提取出来的蛋白多肽不利于人体吸收利用;而其他的分离纯化乳清蛋白的方法，往往都是从大豆生产废水中提取乳清蛋白，由于初始原料的不同，无法进行技术的直接转用，更无法保证豌豆白蛋白的回收率和纯度。
抗菌肽是一类具有抗菌活性的多肽，通过作用于细菌细胞膜，破坏其完整性并产生穿孔现象，进入细胞内，破坏其细胞器引起代谢紊乱。抗菌肽不仅对细菌、真菌有较好的杀菌作用，它也有抗病毒活性、促进伤口愈合的作用。虽然抗菌肽具有广阔的应用前景和巨大的开发潜力，但是抗菌肽的产业化进程比较缓慢。目前生产抗菌肽的主要方法是基因工程技术生产抗菌肽，生产成本高，易被酶解，产业化规模有待突破。而且，生产的抗菌肽活性低，耐热性和热稳定性较差。
目前对于豌豆豆清水的处理除了分离出各种蛋白以外，基本没有其他的处理方式，这也造成了抗菌肽的损失。
发明内容
本发明提供一种从豌豆豆清废水中提取抗菌肽及白蛋白的方法，解决背景技术中无法从豌豆豆清废水中提取分子量小的白蛋白导致的资源浪费、白蛋白回收处理利用率低、无法对白蛋白进行目标性提取以及抗菌肽损失的问题。
具体技术方案如下：
一种从豌豆豆清废水中提取抗菌肽的方法，其特征在于，以豌豆蛋白加工过程中产生的豌豆豆清废水为原料，进行离心分离后，通过控温换热调节原料温度，然后依次经过微滤、纳滤、超滤、二级纳滤步骤，得到白蛋白浆液;将白蛋白浆液经过多效浓缩后，添加碱性物质调节pH，再经过杀菌和干燥，得到白蛋白;
将白蛋白加水得到白蛋白浆液之后，进行水浴预处理，冷却后放在恒温磁力搅拌器上搅拌，随后加入木瓜蛋白酶，滴加碱溶液保持酶解液pH不变;充分酶解后，煮沸灭酶，冷却后调节pH 至7.0;离心，上清液进行旋转蒸发浓缩，采用0.22μm的针头式滤膜除菌，得到抗菌肽初产物;
将抗菌肽初产物通过萃取器，该萃取器预先用甲醇水溶液清洗并活化然后用三氟乙酸水溶液清洗并平衡;依次使甲醇水溶液和三氟乙酸水溶液通过上述萃取器并收集穿透液，将穿透液采用旋转蒸发仪真空浓缩，取出抗菌肽浓缩液于-15℃冷冻，然后将结冰的抗菌肽置于真空冷冻干燥机中进行干燥，得到纯化后的抗菌肽;
所述抗菌肽具有如下特征：利用酸度计测定抗菌肽的PH值为2.56-2.78;
所述抗菌肽分子中含有：甘氨酸、半胱氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸、丙氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、谷氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、酪氨酸。
一种从豌豆豆清废水中提取白蛋白的方法，以豌豆蛋白加工过程中产生的豌豆豆清废水为原料，进行离心分离后，通过控温换热调节原料温度，然后依次经过微滤、纳滤、超滤、二级纳滤步骤，得到白蛋白浆液;将白蛋白浆液经过多效浓缩后，添加碱性物质调节pH，再经过杀菌和干燥，得到白蛋白。
优选的，具体步骤为：
1)离心分离：以豌豆豆清废水为原料，进行离心分离;
2)控温换热：将离心分离后得到的豆清水进行换热处理;
3)微滤：将换热处理后的豆清水进行微滤处理;
4)纳滤：采用纳滤模组，调节系统压力以及过滤温度，去除93%-95%的水分;
5)超滤：采用超滤膜，经过5-10次洗脱分离，得到粗品白蛋白浆液;
6)二级纳滤：选用抗污染纳滤膜，加入清水洗涤粗品白蛋白，洗涤完成后去除用于洗涤的清水;
7)多效浓缩：将洗涤好的白蛋白浆液，加入到蒸发器中进行蒸发浓缩;
8)中和：在不锈钢罐内添加碱性物质，调节pH;
9)杀菌、干燥。
优选的，所述控温换热时的温度为40-50℃。
优选的，所述微滤过程中采用的膜是碳化硅膜或陶瓷膜。
优选的，所述碳化硅膜的孔径为10纳米-30微米。
优选的，所述纳滤过程中，调节系统压力为18-25bar ，过滤温度为40-65℃。
优选的，所述超滤过程中，采用孔径可隔离分子量为1000-5000道尔顿的超滤膜。
优选的，所述二级纳滤过程中，用于洗涤的清水为步骤4)中纳滤后得到的93%-95%的清水。
优选的，所述多效浓缩过程中，蒸汽压力为0.6～0.8Mpa;浓缩后的出料浓度为25%-50%;所述中和过程中，在温度为40-65℃条件下，向体系内加入碱性物质，调节pH值至6.5-8。
有益效果：
1.本发明通过整体工艺流程的设定，对豌豆豆清废水中进行了小分子量的白蛋白的针对性提取，对豌豆豆清水控温换热前首先进行了离心分离，将豆清水中的大分子蛋白分离出去，保证白蛋白和豌豆低聚糖进入下道工序不堵塞设备，为后续白蛋白分子量的相对平均化奠定基础。
2.在超滤时，采用孔径可隔离分子量为1000-5000道尔顿的超滤膜，能够确保白蛋白分离纯度和分子量集中在1000-5000道尔顿区间，白蛋白分子量范围在1000-5000之间的占比为85%，分子量相对平均，且分子量较小，易于被人体吸收利用。
3.在微滤之前进行了控温换热，保证豆清水的温度稳定，使其达到进入微滤前的最佳运行温度，为后续有效进行分离奠定基础;微滤步骤对豆清水中离心机未分离干净的大分子蛋白进行进一步的分离，为后续纳滤步骤奠定基础;纳滤时采用纳滤模组，对白蛋白进行进一步分离，同时去除93%-95%的水分，纳滤完之后的白蛋白中仍然含有少量低聚糖;此时再进行超滤步骤将白蛋白和低聚糖分离开，但是此时白蛋白中仍然含有多余的盐分，导致白蛋白纯度较低，再进行二级纳滤，选用卫生级抗污染纳滤膜，加入纳滤时分离出来的清水洗涤，洗脱多余的盐分，洗涤完成后上述清水分离出来，循环使用，经过上述一系列步骤，能够有效回收豌豆豆清水中的小分子量的白蛋白，且纯度较高，避免对豌豆豆清水处理不当造成的环境污染，实现资源再利用。
4.本发明未采用常规的酶解工艺，在保证产品回收率的基础上，最大限度的保证了白蛋白的口感，没有异味和苦味，产品质量高;本发明基本采用物理提取方式，不涉及化学反应，使得白蛋白中的氨基酸保存较为完整，种类齐全，含有多种氨基酸，与纯白蛋白的氨基酸含量相近，产品性能好，具有较高的营养价值。
5.本方案通过多种分离和水洗流程，去除豆清水中大分子蛋白，有效的减少了大分子蛋白对后续白蛋白分离工艺的干扰，保证白蛋白的纯度;工艺技术环节采用脱盐工艺，将白蛋白中的盐分通过水洗，纳滤膜分离技术，去除豆清蛋白的酸涩味道。
6.本发明在纳滤时采用纳滤模组，对白蛋白进行进一步分离，同时去除93%-95%的水分，这部分水能够在二次纳滤时再次进行循环利用，减少了污水处理过程，节约能源和水资源。
7.本发明采用豌豆蛋白加工过程中的豆清水，提供了针对豆清水回收再利用的两种方式，不仅能够提取得到抗菌肽，同时能够提取出小分子量的白蛋白，提高了豆清废水的回收再利用率。且本发明提供的提取抗菌肽的方法，不仅可以以豆清水为原料，亦可以以本发明提取出来的白蛋白为原料进行再加工，提取出具有良好的耐热性和热稳定性的抗菌肽。
8.本发明在进行抗菌肽的提取时，加入木瓜蛋白酶，随时滴加NaOH保持酶解液pH不变;充分酶解反应5-8h后，煮沸15 min灭酶，冷却后用NaOH或HCl调至pH 7.0;在8500 r/min下离心20 min去沉淀，上清液进行旋转蒸发浓缩，采用0.22μm的针头式滤膜除菌，有效控制蛋白质的水解程度，且不会破坏多肽中的氨基酸，使得抗菌肽氨基酸种类丰富，受热作用后不易发生变性，具有较好的耐热性和热稳定性。（发明人张树成;杨进洁;武世敏;臧庆佳;杨国栋）
