申请日2016.12.17
公开(公告)日2017.05.31
IPC分类号C12Q1/64; C12Q1/02
摘要
本发明公开了一种利用青海弧菌Q67测试采油废水生物毒性的方法。以采油废水为测试废水，以青海弧菌Q67为指示生物，以96孔微孔板为载体;通过96孔微孔板分析方法，采用微孔板分光光度计来检测其发光强度;利用实验组与对照组的发光强度来计算发光抑制率，设定Zn(NO3)2作为毒性参照物，从而判断采油废水的生物毒性。本发明方法利用微板法对采油废水的毒性进行检测分析，通过计算发光菌的发光抑制率，从而判断采油废水的综合毒性大小，解决了常规理化指标不能表示采油废水生物毒性的问题，快速、灵敏、便于推广应用，并且所选用的毒性参照物Zn(NO3)2实验结果稳定，价格便宜，毒性中等。
摘要附图
权利要求书
1.一种利用青海弧菌Q67测试采油废水生物毒性的方法，其特征在于具体步骤为：
(1)将采回的浑浊采油废水用0.45μm滤膜过滤，制得处理后的采油废水，然后将其置于4℃的冰箱中保存待用，假设处理后的采油废水的浓度为单位1;
(2)培养青海弧菌Q67使其达到对数生长期，得到青海弧菌Q67菌液，将其作为工作菌液;
(3)将工作菌液加入到预先设置好采油废水浓度梯度的白色不透明96孔微孔板中，制作采油废水和工作菌液的反应体系，每孔总体积为200μL，实验孔每孔含100μL工作菌液和100μL不同浓度的采油废水，空白对照孔每孔含100μL工作菌液和100μL超纯水，使工作菌液与采油废水充分反应15min，然后用Synergy H2微孔板分光光度计测定其发光强度RLU，相同条件下，每个采油废水浓度进行9次重复实验，并取平均值;
(4)设定Zn(NO3)2作为毒性参照物，用超纯水将Zn(NO3)2稀释不同浓度梯度，然后加入工作菌液充分反应15min，采用Synergy H2微孔板分光光度计测定其发光强度，计算发光抑制率并用Origin9.0中的Logistic函数对发光抑制率与Zn(NO3)2浓度进行拟合，建立浓度-效应曲线;
(5)采用Synergy H2微孔板分光光度计检测微孔板发光强度，利用实验组与对照组的发光强度计算出不同浓度采油废水对青海弧菌Q67的发光抑制率E，以采油废水不同浓度为横坐标，以不同浓度对应的发光抑制率为纵坐标，利用Origin9.0中的Logistic函数对不同浓度采油废水与发光抑制率E进行非线性拟合;
式中：I0为空白对照样的RLU平均值，I为各浓度9次平行样的RLU平均值;对照相同发光抑制率下Zn(NO3)2的浓度，根据毒性参照物Zn(NO3)2判断采油废水的综合毒性大小，具体如下：
Zn(NO3)2的浓度C<0.29mg/L时，毒性级别为微毒或无毒;Zn(NO3)2的浓度0.29mg/L≤C<1.11mg/L时，毒性级别为低毒;Zn(NO3)2的浓度1.11mg/L≤C<1.60mg/L时，毒性级别为中毒;Zn(NO3)2的浓度1.60mg/L≤C<2.91mg/L时，毒性级别为高毒;Zn(NO3)2的浓度C≥2.91mg/L时，毒性级别为剧毒。
说明书
一种利用青海弧菌Q67测试采油废水生物毒性的方法
技术领域
本发明属于废水生物毒性检测领域，特别涉及一种利用青海弧菌Q67测试采油废水生物毒性的方法。
背景技术
采油废水是油田在采油过程中，除作为回注、工艺回掺或其它用途等生产用水以外，需外排的废水。其中含有石油类、表面活性剂等高分子难降解有机污染物。采油废水具有盐度高,水温高的特点，对接触的物体具有一定的腐蚀性，除此之外，废水中还含有一定量的杀菌剂。现存的《污水综合排放标准》(GB 8978-1996)中规定了废水排放的理化指标限值，但并未涉及废水毒性的排放指标。现阶段，采油废水的生物毒性和对环境的危害，受到了广泛的关注。目前废水生物毒性的检测方法有：发光菌毒性试验，藻类毒性试验，蚤类毒性试验，鱼类毒性试验，鸟类毒性试验等。其中，发光菌作为废水毒性检验的指示生物，具有快速简便的优点。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用青海弧菌Q67测试采油废水生物毒性的方法。
本发明思路：以采油废水为测试废水，以96孔微孔板为载体;通过96孔微孔板分析方法，采用Synergy H2微孔板分光光度计来检测其发光强度;利用实验组与对照组的发光强度来计算发光抑制率，设定Zn(NO3)2作为毒性参照物，从而判断废水的生物毒性。
具体步骤为：
(1)将采回的浑浊采油废水用0.45μm滤膜过滤，制得处理后的采油废水，然后将其置于4℃的冰箱中保存待用，假设处理后的采油废水的浓度为单位1。
(2)培养青海弧菌Q67使其达到对数生长期，得到青海弧菌Q67菌液，将其作为工作菌液。
(3)将工作菌液加入到预先设置好采油废水浓度梯度的白色不透明96孔微孔板中，制作采油废水和工作菌液的反应体系，每孔总体积为200μL，实验孔每孔含100μL工作菌液和100μL不同浓度的采油废水，空白对照孔每孔含100μL工作菌液和100μL超纯水，使工作菌液与采油废水充分反应15min，然后用Synergy H2微孔板分光光度计测定其发光强度RLU，相同条件下，每个采油废水浓度进行9次重复实验，并取平均值。
(4)设定Zn(NO3)2作为毒性参照物，用超纯水将Zn(NO3)2稀释不同浓度梯度，然后加入工作菌液充分反应15min，采用SynergyH2微孔板分光光度计测定其发光强度，计算发光抑制率并用Origin9.0中的Logistic函数对发光抑制率与Zn(NO3)2浓度进行拟合，建立浓度-效应曲线。
(5)采用Synergy H2微孔板分光光度计检测微孔板发光强度，利用实验组与对照组的发光强度计算出不同浓度采油废水对青海弧菌Q67的发光抑制率E，以采油废水不同浓度为横坐标，以不同浓度对应的发光抑制率为纵坐标，利用Origin9.0中的Logistic函数对不同浓度采油废水与发光抑制率E进行非线性拟合。
式中：I0为空白对照样的RLU平均值，I为各浓度9次平行样的RLU平均值;对照相同发光抑制率下Zn(NO3)2的浓度，根据毒性参照物Zn(NO3)2判断采油废水的综合毒性大小，具体如下：
Zn(NO3)2的浓度C<0.29mg/L时，毒性级别为微毒或无毒;Zn(NO3)2的浓度0.29mg/L≤C<1.11mg/L时，毒性级别为低毒;Zn(NO3)2的浓度1.11mg/L≤C<1.60mg/L时，毒性级别为中毒;Zn(NO3)2的浓度1.60mg/L≤C<2.91mg/L时，毒性级别为高毒;Zn(NO3)2的浓度C≥2.91mg/L时，毒性级别为剧毒。
本发明方法利用微板法对采油废水的毒性进行检测分析，通过计算发光菌的发光抑制率，从而判断采油废水的综合毒性大小，解决了常规理化指标不能表示采油废水生物毒性的问题，快速、灵敏、便于推广应用，并且所选用的毒性参照物Zn(NO3)2实验结果稳定，价格便宜，毒性中等。
