申请日2015.11.27
公开(公告)日2016.03.02
IPC分类号C12Q1/68; C12Q1/04
摘要
本发明公开了一种城市污水处理厂/处理站微生物气溶胶的检测方法，包括以下步骤：1)采用中流量便携式大气采样器对城市污水处理厂/处理站收集测试点的微生物气溶胶，收集采样当时的气象参数，2)洗脱采样膜上的颗粒物并提取其总DNA，3)目的片段的扩增和高通量测序，4)序列分析，鉴定微生物气溶胶的群落结构，5)微生物气溶胶群落结构多样性及相似性分析，6)微生物气溶胶逸散特征及源解析。本发明提供了一种提取城市污水处理厂/处理站微生物气溶胶中微量DNA可行的方法，为解析微生物气溶胶的逸散特征和多样性提供了最根本的前提和基础。
权利要求书
1.一种城市污水处理厂/处理站微生物气溶胶的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)采样器及其配件准备，采样膜及其采样膜收集器具的准备及高温高压灭菌;
2)城市污水处理厂微生物气溶胶现场采样，运行空气采样泵，抽滤空气至无菌的玻璃纤维滤膜上，截留空气微生物至采样膜上，记录采样过程中的气象参数;
3)采样膜的收集及存放，用无菌镊子将截留空气微生物的采样膜转移至无菌铝箔纸上密封，如不能立即对样品进行后续处理，将其冻存-20℃或者-80℃的冰箱内待用;
4)DNA提取，提取玻璃纤维膜上的微生物DNA;
5)目的片段扩增，细菌16SrRNA和真菌18S基因PCR扩增;
6)高通量测序，利用高通量测序技术对细菌和真菌的目的序列进行测序;
7)序列分析，将下机的目的片段DNA序列对原始数据进行过滤处理，得到优化序列，去除嵌合体序列后进行OTU聚类分析，对OTU的代表序列在Silva数据库中进行比对分析，鉴定微生物气溶胶中细菌和真菌的分类;
8)群落结构及多样性分析，根据鉴定的细菌和真菌的分类信息，对微生物气溶胶的群落结构和多样性进行分析。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤1)中采样器采用中流量总悬浮微粒便携式采样器，配以总悬浮颗粒物的颗粒物切割器，采样膜为亲水性的玻璃纤维膜，采样膜收集器具包括无菌的镊子、铝箔纸、自封袋、直径为90mm的玻璃平板或者无菌一次性塑料培养皿。
3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤2)中采样泵安装高度为人呼吸高度，即距地面垂直高度1.5m处;对于污水处理厂的生物处理单元处，分别在水面处、距地面垂直高度1.5m处、距地面垂直高度4m处设置三个采样点;采样流量为100L/min，玻璃纤维膜为直径90mm、对0.3μm 标准粒子的截留率>99.95%的圆形采样膜，采样时间设置为1h，2h，4h，8h，12h和24h，采样的同时记录当时的气象条件。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤4)中玻璃纤维膜的颗粒物上附着的微生物的总DNA提取包括以下仪器、器具和试剂：低温低速离心机、真空隔膜泵、玻璃过滤系统、与玻璃过滤系统尺寸配套的水系滤膜、剪刀、镊子、50mL血清瓶、1×PBS缓冲液，，DNA提取试剂盒，除离心机和抽滤泵外，其他均需在121℃灭菌15min。
5.如权利要求1或4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤4)中总DNA的提取方法如下：将冻存于 -20℃或者-80℃的冰箱内的玻璃纤维膜样品置于超净台中，用无菌的镊子夹取采样膜，用无菌剪刀将其剪碎置于无菌的50mL血清瓶中，取适量无菌的1×PBS缓冲液冲洗剪碎的玻璃纤维膜并将其浸没，封盖后上下颠倒血清瓶数次，冲洗采样膜的颗粒物至缓冲液中，将其置于低温低速离心机中，200g离心2h，安装真空过滤系统，将上述离心后的缓冲液避开剪碎的滤膜倒入滤杯中，浓缩颗粒物至水系膜上，用无菌镊子夹取该滤膜，按照DNA提取试剂盒的使用说明，对滤膜浓缩的颗粒物进行总DNA的提取，由于空气中微生物的总DNA含量较低，在总DNA提取的最后一步，用50μL溶液收集总DNA，以提高总DNA的最终浓度。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤5)中目的片段的扩增，细菌16SrRNA扩增采用引物338F/806R，真菌18S基因扩增引物采用引物0817F/1196R。
7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤6)中高通量测序，采用IluuminaMiseq测序平台，细菌采用PE250测序文库，真菌采用PE300测序文库。
8.如权利要求1-7任一所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括：微生物气溶胶的源解析及逸散规律评估，比较不同污水处理工段微生物气溶胶样品之间的相似性，同时对城市污水处理厂微生物气溶胶进行源解析，以综合评估微生物气溶胶的逸散特征。
9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括：特征序列数据库的构建，建立城市污水处理厂/处理站微生物气溶胶中特征的细菌和真菌序列信息数据库，尤其是致病菌的序列信息。
10.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述微生物气溶胶的源解析和逸散规律评估，对比城市污水厂/处理站主体污水处理工段粗格栅、细格栅、初沉池、曝气池、二沉池或氧化沟与背景对照点污水厂/站的上风向或下风向微生物气溶胶的微生物种类之间的相似性，以解析来源于城市污水过程中的特征微生物种类，并结合气象参数对其逸散规律做出评估。
说明书
一种城市污水处理厂/处理站微生物气溶胶的检测方法
技术领域
本发明涉及环境微生物分析技术领域，具体涉及城市污水处理厂/处理站微生物气溶胶中全部微生物的检测分析方法。
背景技术
生物气溶胶是指具有生命的气溶胶粒子(包括细菌、真菌、病毒等微生物粒子)和活性粒子(花粉、孢子等)以及由有生命活性的机体所释放到空气中的各种质粒。污水中存在的多种微生物，在污水处理过程中，曝气、机械搅拌及污泥脱水等环节可使其以气溶胶的形式释放周边的空气中。研究表明，城市污水处理厂/处理站逸散的微生物气溶胶中含有大量的致病菌或条件致病菌，对污水处理厂/污水处理站工作人员、附近居民健康及环境具有较大的潜在危害。因而，探明城市污水处理厂、污水处理站微生物气溶胶的群落结构，解析生物气溶胶的微生物菌群在逸散过程中的演替规律逸散特征，对于污水处理厂微生物气溶胶的控制及人员健康防护都具有重要的研究和指导意义。
目前，城市污水处理厂/处理站(wastewatertreatmentplant/station，简称WWTP/WWTS)逸散的微生物气溶胶采集方法主要包括可培养方法和不可培养方法两种。
1)琼脂培养基-Andersen固体撞击式采样法是国际标准的可培养微生物气溶胶采集方法，可对微生物气溶胶的群落结构、浓度以及粒径分布等特征进行研究。该方法为传统的微生物培养方法，操作繁琐，需要大量的人力物力;而研究也表明，可培养的微生物仅占环境微生物的1%-10%，因而，该方法并不能高效、有效地反映城市污水处理厂微生物气溶胶的分布及组成特征。
2)SKC-Sampler液体撞击式采样法是国际标准的微生物气溶胶不可培养采集方法，作为标准方法广泛应用于气溶胶中全部微生物的收集，对于微生物群落信息能够较全面的反映。获取微生物气溶胶的DNA是后续微生物特征解析的前提，但是，空气中的微生物数量相对于其他生境(土壤、水体)要低很多，不经培养过程直接对空气中的微生物提取DNA是一直以来的难题。
SKC-Sampler液体采样器流量小(额定流量为12.5L空气/min)，要获取足够的样本量提取DNA需要长时间的样品收集;该方法中的微生物气溶胶收集液(PBS缓冲液)在样品采集过程中会大量挥发，需要反复添加收集液以保证其正常运行;同时，受制于其收集液在低温条件(<0℃)下会结冰，该方法并不能完成在任一时间的样品采集任务。
参考常见的大流量大气采样器(流量>100L/min)的大气采样器一般安装于某固定采样点，而对于不同污水处理厂/处理站之间的调研安排、以及多个采样点之间频繁更换的要求并不能满足。
以上缺点，使得两种国际标准的生物气溶胶采集方法，都不能实现对城市污水处理厂微生物气溶胶中全部微生物的现场采样目的，以及后续的微生物群落结构及逸散特征的解析。
发明内容
本发明的目的在于提供一种城市污水处理厂/处理站微生物气溶胶中全部微生物高效采集和分析的方法，即能够克服营养琼脂-Andersen固体撞击式采样法和SKC-Sampler液体撞击式采样法应用于城市污水处理厂微生物气溶胶收集过程中的弊端。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种城市污水处理厂/处理站微生物气溶胶的检测方法，包括以下步骤：
1)采样器及其配件准备，采样膜及其采样膜收集器具的准备及高温高压灭菌;
2)城市污水处理厂微生物气溶胶现场采样，运行空气采样泵，抽滤空气至无菌的玻璃纤维滤膜上，截留空气微生物至采样膜上，记录采样过程中的气象参数;
3)采样膜的收集及存放，用无菌镊子将截留空气微生物的采样膜转移至无菌铝箔纸上密封，如不能立即对样品进行后续处理，将其冻存-20℃或者-80℃的冰箱内待用;
4)DNA提取，提取玻璃纤维膜上的微生物DNA;
5)目的片段扩增，细菌16SrRNA和真菌18S基因PCR扩增;
6)高通量测序，利用高通量测序技术对细菌和真菌的目的序列进行测序;
7)序列分析，将下机的目的片段DNA序列对原始数据进行过滤处理，得到优化序列，去除嵌合体序列后进行OTU聚类分析，对OTU的代表序列在Silva数据库中进行比对分析，鉴定微生物气溶胶中细菌和真菌的分类;
8)群落结构及多样性分析，根据鉴定的细菌和真菌的分类信息，对微生物气溶胶的群落结构和多样性进行分析;
还可以包括：
9)源解析及逸散规律评估，比较不同污水处理工段微生物气溶胶样品之间的相似性，同时对城市污水处理厂微生物气溶胶进行源解析，以综合评估微生物气溶胶的逸散特征;
10)特征序列数据库的构建，建立城市污水处理厂/处理站微生物气溶胶中特征的细菌和真菌序列信息数据库，尤其是致病菌的序列信息。
该检测方法可以应用于不同运行工艺及不同气象条件下的污水处理厂/污水处理站微生物气溶胶的检测，即室内和室外大气环境均可实现。
为了更好地实现本发明目的，进一步的技术方案如下：
所述步骤1)中采样器为中流量总悬浮微粒采样器，配以总悬浮颗粒物(TotalSuspendedParticulate，简称TSP)的颗粒物切割器，采样膜为亲水性的玻璃纤维膜，采样膜收集器具包括无菌的镊子、铝箔纸、自封袋、直径为90mm的玻璃平板或者无菌一次性塑料培养皿，由于在城市污水处理厂/处理站内电力的使用受到严格管制，所以需要额外自备电力输出线圈若干(因现场情况决定)，线路连接完毕，将灭菌的 TSP切割器和滤膜安装于采样泵上，即可完成采样点的微生物气溶胶样品的采集。
所述步骤2)中采样泵安装高度为人呼吸高度，即距地面垂直高度1.5m处;对于污水处理厂的生物处理单元处，分别在水面处、距地面垂直高度1.5m处、距地面垂直高度4m处设置三个采样点。采样流量为 100L/min，玻璃纤维膜为直径90mm、对0.3μm标准粒子的截留率>99.95%的圆形采样膜，采样时间设置为1h，2h，4h，8h，12h和24h，采样的同时记录当时的气象条件。
所述步骤3)中无菌镊子和无菌铝箔纸，事先在高温、高压灭菌锅中用牛皮纸或者耐高温、高压容器包裹，121℃灭菌15min。
所述步骤4)中玻璃纤维膜的颗粒物上附着的微生物的总DNA提取包括以下仪器、器具和试剂：低温低速离心机、真空隔膜泵、玻璃过滤系统、剪刀、镊子、50mL血清瓶、1×PBS缓冲液，孔径为0.22μm、直径为25mm的聚醚砜滤膜(PES)，DNA提取试剂盒，除离心机和抽滤泵外，其他均需在121℃灭菌15min;总DNA的提取方法如下：将冻存于-20℃或者-80℃的冰箱内的玻璃纤维膜样品置于超净台中，用无菌的镊子夹取采样膜，用无菌剪刀将其剪碎置于无菌的50mL血清瓶中，取40mL无菌的1×PBS缓冲液冲洗剪碎的采样膜并将其浸没，封盖后上下颠倒血清瓶数次，尽可能多地冲洗采样膜的颗粒物至缓冲液中，将其置于低温低速离心机中，200g离心2h，安装真空过滤系统，将上述离心后的缓冲液(避开剪碎的滤膜) 倒入滤杯中，浓缩颗粒物至PES膜上，用无菌镊子夹取该滤膜，用DNA提取试剂盒对滤膜浓缩的颗粒物进行总DNA的提取，由于空气中微生物的总DNA含量较低，在总DNA提取的最后一步，用50μL溶液收集总 DNA，以提高总DNA的最终浓度。
所述步骤5)中目的片段的扩增，细菌16SrRNA扩增采用引物338F/806R(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3' /5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')，真菌18S基因扩增引物采用引物0817F/1196R (5'-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3'/5'-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3')。
所述步骤6)中高通量测序，采用IluuminaMiseq测序平台，细菌采用PE250测序文库，真菌采用PE300 测序文库。
所述步骤9)中微生物气溶胶的源解析和逸散规律评估，对比城市污水厂/处理站主体污水处理工段(粗格栅、细格栅、初沉池、曝气池、二沉池、氧化沟等)与背景对照点(污水厂/站的上风向、下风向等) 微生物气溶胶的微生物种类之间的相似性，以解析来源于城市污水过程中的特征微生物种类，并结合气象参数对其逸散规律做出评估。
有益效果：
本发明提出的一种城市污水处理厂/处理站微生物气溶胶的检测方法，通过便携式的空气采样器，采用膜采样法对空气TSP收集以完成对不同污水处理厂/处理站、不同站点的全部空气微生物的收集，在收集足够体积空气样品的前提下，优化的DNA提取方法克服了空气样品中微生物含量低，难以获取样品总DNA 的难题，可提供浓度高、纯度高的总DNA样品，为后续高通量测序提供基础。
采用目前常用的基于培养计数法的Andersen固体冲击式采样法、SKC液体撞击式采样法(采样时间 24h)与本发明方法(采样时间4h)分别对同一污水站内细菌气溶胶样品进行采集，测序分析样品中微生物菌门分布的结果如附图6。由图可见，Andersen采样法仅获取了隶属于Firmicutes(62.97%)和 Proteobacteria(37.03%)两个菌门的细菌，采样时间为24h的SKC采样法获取了Firmicutes(46.62%)、 Proteobacteria(41.25%)和Actinobacteria(12.13%)三个菌门的细菌，而采用本发明提供的方法，仅需4h即可获得包括Cyanobacteria，Proteobacteria，Actinobacteria，Firmicutes，Bacteroidetes， Deinococcus-Thermus，Chloroflexi在内的七种菌门的细菌。即本发明提供一种城市污水处理厂/处理站微生物气溶胶的检测方法在克服了Andersen可培养采样法和SKC采样法弊端的前提下，采用时间大大缩短、操作简便且不受气象条件限制，更好的完成了对微生物气溶胶的采集和表征。
