申请日2015.02.28
公开(公告)日2015.11.25
IPC分类号C12N1/20; C02F3/34; C02F101/38; C02F103/24; C12R1/125
摘要
本发明公开一种枯草芽孢杆菌(Bacillus?subtilis)在处理制革废水总氮中的应用，利用枯草芽孢杆菌处理制革废水总氮包括以下步骤：(l)培养基配制;(2)发酵：将枯草芽孢杆菌菌种接种至装有培养基的摇瓶，进行发酵得发酵液;(3)生物絮凝剂的提取：发酵液经离心、萃取、再离心、真空冷冻干燥得生物絮凝剂产品;(4)废水处理：将生物絮凝剂加入装有制革废水的烧杯中，于磁力搅拌器上进行搅拌处理。本发明用新的生物絮凝剂处理制革废水中的总氮，去除效率可达到81.2%，发挥生物絮凝剂绿色环保、不产生二次污染等独特性能，为去除制革废水中的高浓度总氮提供了新方法，拓宽了对枯草芽孢杆菌功能方面的应用，具有较强的应用价值。
权利要求书
1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的应用，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌其保藏号为CCTCCM2014512，应用于降低制革废水中总氮。
2.根据权利要求1中所述的一种枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌由制革厂的活性污泥中培育和驯化而得。
3.根据权利要求1或2中所述的一种枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述培育和驯化步骤如下：(1)菌种的富集培养：
采集制革厂的活性污泥接种至已灭菌并冷却的LB培养基中，污泥与培养基的培养比例是体积比约1:8-12，于28-32℃摇床培养46-50h，LB培养基配制如下：蛋白胨8-12g，酵母膏4-7g，NaCl8-12g，加蒸馏水到1000mL，pH6.8-7.2，115-125℃灭菌15-25min;
(2)菌种的驯化：
将5mL富集培养菌液接种于100mL含有制革废水的LB培养基中28-32℃振荡培养45-50h，并逐渐增加制革废水的量至40mL、60mL、80mL，逐级驯化;
(3)菌种的分离：
通过稀释平板法，以固体LB培养基为分离培养基，从已驯化的菌液中分离出各种细菌，并对各菌株进行纯化，得到枯草芽孢杆菌菌种。
4.根据权利要求3中所述的一种枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述培育和驯化还包括生物絮凝剂产生菌的筛选，如以下步骤：
(1)初筛
将分离纯化出的枯草芽孢杆菌菌株接种于絮凝培养基中进行培养，将培养液离心，取上清液进行絮凝活性的初筛，即：取2mL培养液加入100mL4g/L高岭土悬浮液中，同时以不加培养液的高岭土悬浮液进行对照，观察，以是否出现絮凝来判断是否具有絮凝活性从而进行初筛，若絮凝，则初步判定有产生物絮凝剂的能力;絮凝培养基配制如下：NaNO31-3g，KC10-11g，K2HPO40.5-1.5g，MgSO40.3-0.7g，FeSO40.01g，蔗糖27-32g和蒸馏水1L，除FeSO4外，其余原料均在115-125℃灭菌15-25min，待灭完菌冷却后，将FeSO4溶解于灭菌后的蒸馏水中，过滤，再将过滤后的FeSO4溶液加入该培养基内;
(2)复筛
将初筛出的具有絮凝能力的菌株分别接种于絮凝培养基中培养，45-50h后，以絮凝率的大小作为衡量菌株产絮凝剂能力的大小，从中选出具有生物絮凝剂产生的枯草芽孢杆菌。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的一种枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于：利用纺锤芽孢
杆菌处理制革废水总氮的方法包括以下步骤：
(l)培养基配制：NaNO31.5-2.5g，KC10-11g，K2HPO40.6-1.2g，MgSO40.3-0.7g，FeSO40.01g，蔗糖28-32g和蒸馏水1L，除FeSO4外，其余原料均在115-125℃灭菌15-25min，待灭完菌冷却后，将FeSO4溶解于灭菌后的蒸馏水中，过滤，再将过滤后的FeSO4溶液加入该培养基内;
(2)发酵：将枯草芽孢杆菌菌种接种至装有50mL培养基的250mL摇瓶，放在转速为180r/min的摇床内，于32-38℃条件下振荡培养45-50h;培养后的菌种再接种至装有100mL培养基的250mL锥形瓶，然后于32-38℃条件下振荡培养24～68h得发酵液，菌种与培养基的接种量比例是体积比1:8-12;
(3)生物絮凝剂的提取：将发酵液放入转速为5000-10000r/min的离心机中，离心10min，收集上清液，然后在上清液中加入2-4倍体积的乙醇，所得混合物在3-5℃下静置5-7h后再将混合物放入转速为5000～10000r/min的离心机中，离心8-12min，收集沉淀，用蒸馏水溶解2.5-3.5h，将溶解液放入转速为5000～10000r/min的离心机中，离心8-12min，所得沉淀物再用蒸馏水溶解2-3h，反复透析1～2次，再将离心的沉淀物置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，得生物絮凝剂成品;
(4)废水处理：将生物絮凝剂加入装有制革废水的烧杯中，于磁力搅拌器上进行反应。
6.根据权利要求4或5中所述的一种枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述絮凝培养基或培养基的pH6.7-7.2。
7.根据权利要求5中所述的一种枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述步骤(3)中乙醇为预冷乙醇，温度3-5℃。
8.根据权利要求5中所述的一种枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述步骤(3)中离心机的转速为8000r/min。
说明书
一种枯草芽孢杆菌在处理制革废水总氮中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)在处理制革废水总氮中的应用。
背景技术
皮革业是高污染行业，随着皮革工业产量的增加，制革工业排放的污染物也在不断增加，制革废水污染环境问题日益突出。
由于制革工艺的特点，决定了制革废水成分复杂、颜色深，总氮比较高。总氮(TN)包括废水中的所有含氮化合物，即有机氮(蛋白质、多肽、氨基酸和尿素等)和无机氮(氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮)。众所周知，水体中过多的氮能引起水体富营养化，造成水质恶化，鱼类及其它生物大量死亡;此外，亚硝酸盐可形成致癌物亚硝胺，危害人畜的生命健康;硝酸盐氮可被还原为亚硝酸盐氮;而氨氮会污染大气，用含过量氨氮的废水灌溉土壤时还会导致农作物受到严重危害。
制革废水中的总氮主要来自两个方面：一是制革脱灰和软化过程中要用到无机铵盐，目前从成本和使用效果来看，还没有可以全部替代无机铵盐的脱灰剂;另一方面制革是以加工胶原纤维——蛋白质为主要原料的过程，大量的皮蛋白将被水解到废水中，随着废水中蛋白质的氨化，废水中总氮特别是氨氮浓度迅速升高，这使得废水中氨氮浓度很高，达到300-600mg/L，有时候甚至出现废水越处理氨氮浓度越高的现象。在国家环境保护部于2013年12月27日正式发布的《制革及毛皮加工工业水污染物排放标准》(GB30486—2013)中，明确新设置了总氮控制指标，规定了对污染物总氮的排放限值，对制革现有企业(2014.7.1～2015.12.31)、现有企业(自2016年1月1日起)、新建企业和特别保护地区的总氮直接排放限值分别为70、50、50、20mg/L。由此可见，对制革废水中总氮的治理已不容忽视。
长期以来，人们较重视对氨氮的处理，对制革废水中总氮的治理在之前并没有引起太多关注。目前控制制革废水中总氮的方法主要有：(1)清洁化生产，即控制源头。近几年学者们致力于开发清洁化脱灰和鞣制工艺，以尽可能减少废水中总氮的含量。(2)生化处理技术。近几年来研究者们探索了去除制革废水中总氮的不同生化方法，包括厌氧-好氧(A/O)工艺、生物膜反应器(MBR)方法等。为了使制革废水中的总氮能达到新的国家排放标准，在采用清洁生产工艺、从源头降低污染物总氮的同时，需要寻找有效的废水处理新技术。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供一种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的应用，所述枯草芽孢杆菌保藏号为CCTCCM2014512，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期是2014年10月26日，通过从枯草芽孢杆菌菌种中提取出生物絮凝剂，并用该生物絮凝剂处理制革废水中的总氮，绿色环保、不产生二次污染等，消除制革生产中产生的高浓度总氮废水对环境的污染，并构建清洁的制革废水中总氮处理新技术。
解决以上技术问题的一种枯草芽孢杆菌的应用,其特征在于：保藏号为CCTCCM2014512，所述枯草芽孢杆菌应用于降低制革废水中总氮。
所述枯草芽孢杆菌由制革厂的活性污泥中培育和驯化而得。
所述培育和驯化步骤如下：
(1)菌种的富集培养：
采集制革厂的活性污泥接种至已灭菌并冷却的LB培养基中，污泥与培养基的培养比例是体积比约1:8-12，于28-32℃摇床培养46-50h，LB培养基配制如下：蛋白胨8-12g，酵母膏4-7g，NaCl8-12g，加蒸馏水到1000mL，pH6.8-7.2，115-125℃灭菌15-25min;摇床转速是100r/min。
(2)菌种的驯化：
将5mL富集培养菌液接种于100mL含有制革废水的LB培养基中28-32℃振荡培养45-50h，并逐渐增加制革废水的量至40mL、60mL、80mL，逐级驯化;逐级驯化，其目的是为了使培养的菌种能够适应制革废水的高浓度总氮。
通过步骤(1)培养后的活性污泥，即为富集培养菌液。
驯化过程中菌落是否驯化成功，是通过检测每一级驯化时培养前后含有制革废水的LB培养基的总氮去除率是否始终维持在较高水平而定的，若总氮去除率始终维持在较高水平，则可进行下一级驯化;在好氧反应器中进行驯化;驯化培养基都为LB培养基。
③菌种的分离：
通过稀释平板法，以固体LB培养基为分离培养基，从已驯化的菌液中分离出各种细菌，并对各菌株进行纯化。
稀释平板法。即：用无菌移液管吸取20mL已经驯化好的活性污泥，放入带有玻璃珠的三角烧瓶中，振荡，将各种菌的细胞充分分散(用显微镜观察，细胞呈单细胞)。用无菌吸管从中吸取1mL菌体悬浮液加入盛有9mL的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1mL加入另一盛有9mL无菌水的试管中，混合均匀，依此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7不同稀释度的菌体悬浮液。然后用无菌移液管分别吸取不同稀释度的稀释液于无菌培养皿内，再将已灭菌并冷却至45～50℃左右的LB固体培养基倾入到各无菌培养皿内，倾入培养基约为15mL。之后将培养皿在无菌操作台上轻轻前后左右转动，使稀释的菌悬液与融化的琼脂培养基混合均匀，混匀后静置。待平板冷却后，将平板倒置于37℃培养箱中培养1～2天。最后将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到LB培养基的试管斜面上。
纯化的步骤：将每个斜面中接种的菌株，通过前述稀释平板法分离步骤，反复分离菌种，直至所分离的菌种为纯培养，即菌苔长出后，其菌落特征一致即可。
优化方案，本发明中还有生物絮凝剂产生菌的筛选，所述培育和驯化还包括生物絮凝剂产生菌的筛选，如以下步骤：
(1)初筛
将分离纯化出的枯草芽孢杆菌菌株接种于絮凝培养基中进行培养，将培养液离心，取上清液进行絮凝活性的初筛，即：取2mL培养液加入100mL4g/L高岭土悬浮液中，同时以不加培养液的高岭土悬浮液进行对照，观察，以是否出现絮凝来判断是否具有絮凝活性从而进行初筛，若絮凝，则初步判定有产生物絮凝剂的能力，需进一步检测培养液中絮凝剂的絮凝活性大小;絮凝培养基配制如下：NaNO31-3g，KC10-11g，K2HPO40.5-1.5g，MgSO40.3-0.7g，FeSO40.01g，蔗糖27-32g和蒸馏水1L，除FeSO4外，其余原料均在115-125℃灭菌15-25min，待灭完菌冷却后，将FeSO4溶解于灭菌后的蒸馏水中，过滤，再将过滤后的FeSO4溶液加入该培养基内;
(2)复筛
将初筛出的具有絮凝能力的菌株分别接种于絮凝培养基中培养，45-50h后，以絮凝率的大小作为衡量菌株产絮凝剂能力的大小，从中选出具有生物絮凝剂产生的枯草芽孢杆菌。筛选出的枯草芽孢杆菌既能产絮凝剂，有去除污染物的能力。
本发明中一种枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于：利用枯草芽孢杆菌处理制革废水总氮的方法包括以下步骤：
(l)培养基配制：NaNO31.5-2.5g，KC10-11g，K2HPO40.6-1.2g，MgSO40.3-0.7g，FeSO40.01g，蔗糖28-32g和蒸馏水1L，除FeSO4外，其余原料均在115-125℃灭菌15-25min，待灭完菌冷却后，将FeSO4溶解于灭菌后的蒸馏水中，用灭菌过滤器过滤溶解的FeSO4，用无菌移液管吸取过滤后的FeSO4溶液加入该培养基内;
(2)发酵：将枯草芽孢杆菌菌种接种至装有50mL培养基的250mL摇瓶，放在转速为180r/min的摇床内，于32-38℃条件下振荡培养45-50h;培养后的菌种再接种至装有100mL培养基的250mL锥形瓶，然后于32-38℃条件下振荡培养24～68h得发酵液，菌种与培养基的接种量比例是体积比1:8-12;发酵液是指步骤(2)经过培养24～68h的培养液。
(3)生物絮凝剂的提取：将发酵液放入转速为5000-10000r/min的离心机中，离心10min，收集上清液，然后在上清液中加入2-4倍体积的乙醇，所得混合物在3-5℃下静置5-7h后再将混合物放入转速为5000～10000r/min的离心机中，离心8-12min，收集沉淀，用蒸馏水溶解3h，将溶解液放入转速为5000～10000r/min的离心机中，离心8-12min，所得沉淀物再用蒸馏水溶解2-3h，反复透析1～2次，至鼻子闻不到乙醇味为止，以去除小分子和残留的有机溶剂，最后将离心的沉淀物置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，可得到生物絮凝剂成品;
(4)废水处理：将生物絮凝剂加入装有制革废水的烧杯中，于磁力搅拌器上进行反应。
所述絮凝培养基或培养基的pH6.7-7.2。
所述步骤(3)中乙醇为预冷乙醇，温度4℃。
所述步骤(3)中离心机的转速为8000r/min。
本发明中的枯草芽孢杆菌经富集、驯化，适应了含有高浓度总氮废水的环境，能在培养基中培养时分泌出一种代谢产物，即为生物絮凝剂;该生物絮凝剂因主要含有蛋白质、糖类、糖蛋白、糖胺和脂肪等大分子成分，通过离子键、氢键等作用与废水中的固体悬浮物相结合，同时因其具有一些活性基团，克服无机高分子和合成有机高分子絮凝剂本身固有的缺陷，能与废水中的污染物反应，达到去除污染物的目的。蛋白质、糖类、糖蛋白、糖胺和脂肪，而这些成分都是可生物降解的，无毒、无二次污染。
本发明利用枯草芽孢杆菌产生的生物絮凝剂处理制革废水中的总氮，发挥生物絮凝剂绿色环保、不产生二次污染等独特性能，开拓出了去除制革废水中总氮的生物絮凝剂新种类，可以消除制革生产中产生的高浓度总氮废水对环境的污染，并构建清洁的制革废水中总氮处理新技术，从而为去除制革废水中的高浓度总氮提供了新方法;此外，也拓宽了对枯草芽孢杆菌功能方面的应用，使其具有较强的应用价值。
