申请日2015.03.23
公开(公告)日2016.03.16
IPC分类号C12N1/14; C12P7/58; C12R1/645
摘要
本发明提供一株用于转化乳糖废水制备乳糖酸的密孔菌，其分类命名为密孔菌(Pycnoporus?sp.)SYBC-L10，已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC?NO：M2015020。用密孔菌(Pycnoporus?sanguineus)SYBC-L10微生物作为菌种，以乳糖废水为转化底物，添加氮源、无机盐及诱导剂组成发酵培养基，微生物转化制备乳糖酸。在发酵过程中通过添加琥珀酸缓冲液，使得发酵过程中pH保持恒定，提高乳糖废水的转化率，优化条件下转化率达到85%以上。对于乳糖酸的研究，我国在此方面的研究尚属空白。本发明转化的乳糖废水中，根据高效液相色谱法检测其中的乳糖含量为25%左右。
权利要求书
1.一株转化乳糖废水合成乳糖酸的密孔菌及转化方法，其特征在于利用分类命名为密孔菌(Pycnoporussp.)SYBC-L10，保藏编号CCTCCNO：M2015020的密孔菌转化乳糖废水制备乳糖酸，工艺为：
(1)菌种：采用CCTCCNO：M2015020为出发菌株;
(2)菌种保藏：所用菌株在保藏培养基上保藏，3-6个月转接一次;
保藏培养基：PDA培养基;
(3)种子培养：从保藏培养基转入种子培养基需活化1次，每次30℃下培养4d;
(4)微生物转化：将CCTCCNO：M2015020菌株添加到发酵培养基中，利用微生物产的纤维二糖脱氢酶和漆酶将乳糖转化为乳糖酸;
发酵培养基的组分以g/L计为：碳源20-50，有机氮源6-10，无机氮源4-10，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.3，氯化钙0.08，七水硫酸锌0.005，四水硫酸锰0.0015，六水氯化钴0.0015
七水硫酸铁0.005;
所述的碳源为乳糖废水中乳糖，所述的氮源为有机氮源黄豆粉，无机氮源为磷酸氢二铵;
转化底物乳糖在发酵培养基中的浓度为3%-5%W/V，种子液以10%的接种量，接入添加不同氮源以及无机盐组成的发酵培养基中，250mL三角瓶装液量为50mL;在28-30℃，200-220rmp的条件下培养7d，得到含乳糖酸的发酵液;
(5)在发酵过程中通过添加琥珀酸缓冲液，使得发酵过程中pH4.5-5.0保持恒定，以此提高乳糖废水的转化率。
2.根据权利要求1所述一株转化乳糖废水合成乳糖酸的密孔菌及转化方法，其特征在于转化底物乳糖在发酵培养基中的浓度为3%-5%W/V，在28-30℃，200-220rpm的条件下培养7d。
说明书
一株转化乳糖废水合成乳糖酸的密孔菌及转化方法
技术领域
本发明涉及乳糖酸的制备方法，具体涉及一株密孔菌转化乳糖废水制备乳糖酸的方法，属于生物技术领域。
背景技术
乳糖酸(lactobionicacid)是第三代果酸，其集延缓衰老、保湿、抗氧化和促进机体更新等多种功效于一身。是目前最好的果酸代用品。由于其本身存在于有机体中，乳糖酸不存在刺激性问题，具有优异的抗氧化能力，可防止细胞和离体器官受到自由基的伤害;乳糖酸还可避免细胞膜因氧化而受到的破坏，具有极佳的保水性，是化妆品中的重要组分。乳糖酸是器官移植缓冲液中的重要组分，和金属螯合后的产物可降低由于离子催化产生的羟基对组织的损伤。乳糖酸还可增加大环内酯类抗生素的溶解度，如红霉素的乳糖酸水溶液的溶解度比红霉素高出50-100倍;乳糖酸的钙盐的溶解度较高，可用来补充钙的吸收，也可用来做葡萄糖酸钙的过饱和溶液。乳糖酸有较强的甜味，可以降低酸味，可作为食品的添加剂使用。乳糖酸因其和水的高亲和性还可作为洗涤剂的组分。在化妆品中加入乳糖酸，可抗氧化，抗衰老，高保湿等功效。乳糖酸的CAS登录号：96-82-2。
目前乳糖酸的制备方法有化学催化合成法以及微生物转化法。微生物转化法又包括细菌转化法，真菌转化法。化学催化合成法有许多不利的因素，例如产生多种副产物和化学污染物，而形成的众多副产物又使分离，纯化步骤变得复杂化。微生物转化法具有很大的优势，高效，低成本，转化率高，副产物少等优点，但是有些已报道的产乳糖酸的细菌不是安全菌株，难于用于食品等行业的生产。
发明内容
本发明的目的是提供利用真菌将乳糖转化为乳糖酸的方法。具体内容涉及利用密孔菌转化乳糖废水制备乳糖酸的方法。本发明采用的微生物菌种能够将乳糖转化为乳糖酸，转化率高、副产物少，通过发酵取得了显著效果。
本发明的技术方案;一株密孔菌转化乳糖废水制备乳糖酸的菌株，其分类命名为密孔菌(Pycnoporussp.)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCCNO：M2015020。
一种用所述菌株转化乳糖废水制备乳糖酸的方法，以CCTCCNO：M2015020为出发菌株，以乳糖废水中的乳糖为转化底物，采用碳源、氮源及无机盐组成发酵培养基，转化制备乳糖酸，其工艺为：
(1)菌株：采用CCTCCNO：M2015020为出发菌株;
(2)菌株保藏：所用菌种保藏培养基上保存，3-6个月转接一次;保藏培养基：PDA培养基;
(3)种子培养：从保藏培养基转入种子培养基活化1次，30℃下，200rmp摇瓶培养2d;
种子培养基的组分以g/L计为：葡萄糖20，新鲜土豆200，以蒸馏水配制，pH自然;
(4)微生物转化：将CCTCCNO：M2015020菌株添加到发酵培养基中，利用微生物产的脱氢酶、漆酶将乳糖废水中的乳糖转化为乳糖酸;
发酵培养基组分以g/L计为：碳源20-50，有机氮源6-10，无机氮源4-10，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.3，氯化钙0.08，七水硫酸锌0.005，四水硫酸锰0.0015，六水氯化钴0.0015
七水硫酸铁0.005。
所述碳源为乳糖废水中乳糖，以10%v/v添加，所述氮源为：黄豆粉和磷酸氢二铵;
(5)在发酵过程中需要加入弱酸调节pH，优选的是琥珀酸缓冲液。通过添加酸类物质琥珀酸，使得发酵过程中pH4.5-4.8保持恒定，以此提高乳糖的转化率。
所述真菌转化乳糖废水制备乳糖酸的方法，转化底物乳糖在发酵培养基中的浓度优选为3%-5%，在30℃，200rmp的条件下培养7d。
乳糖酸应理解为乳糖酸及其盐类，如乳糖酸钙。
检测乳糖酸的方法如下：
取发酵液离心，上清液经微孔滤膜过滤(0.22μm)，滤液经HPLC分析。HPLC条件：高效液相色谱仪日立chromaster;色谱柱：BIO-RADAminexHPX-87H(7.8×300);流动相为0.005MH2SO4;检测器：紫外检测器，210nm，柱温：50℃，流速：0.4mL/min，进样量：10μL，乳糖酸标样浓度：1%。
本发明的有益效果：本发明提供了一种利用真菌转化制备乳糖酸的方法，表明密孔菌(Pycnoporussp.)SYBCL10在加入的乳糖废水为20%v/v(乳糖废水中乳糖浓度为25%)时培养7d转化率能达到60%，加入的乳糖废水为40%v/v时培养9d，转化率达到45%。
生物材料样品保藏：密孔菌(Pycnoporussp.)SYBCL10已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，简称CCTCC，保藏日期：2015年1月7号，保藏编号CCTCCNO：M2015020。
