申请日2014.02.28
公开(公告)日2014.05.28
IPC分类号G01N30/06; G01N30/88
摘要
本发明涉及一种测定污泥中痕量四环素、土霉素和金霉素含量的方法，包括：(1)将污泥样品离心后真空冷冻干燥，然后捣碎加入EDTA-Mcllvaine缓冲提取液漩涡混合后超声萃取，得上清液;(2)将上清液缓缓流经SPE-HLB小柱，全部萃取后用高纯水清洗小柱，真空干燥后用甲醇将目标物质从SPE-HLB小柱上洗脱下来，收集洗脱液;(3)将洗脱液吹至近干，加入乙腈和水混合液定容，然后针头式过滤器过滤;(4)将步骤(3)得到的液体进行HPLC-MS/MS分析。本发明建立了一种超声-固相联合萃取，然后通过高效液相色谱/质谱来测定污泥中痕量四环素、土霉素和金霉素含量的方法，该方法先进、准确、灵敏。
权利要求书
1.一种测定污泥中痕量四环素、土霉素和金霉素含量的方法，包括：
(1)将污泥样品于8000r·min-1离心10min后，将其中的污泥固体真空冷冻干燥，然 后捣碎并过50目筛，接着准确称量1.000g筛后污泥并置于离心管中，加入10ml EDTA-Mcllvaine缓冲提取液漩涡混合1min后超声萃取10min，并以4000r·min-1离心20 min后，收集上清液;再重复萃取2次，合并3次萃取的上清液;
(2)依次用6mL甲醇、6mL高纯水、6mL Na2EDTA的缓冲液对SPE-HLB小柱进行 活化和平衡，然后以3mL·min-1的流速将步骤(1)得到的上清液缓缓流经SPE-HLB小柱， 全部萃取后用6mL高纯水清洗小柱，接着真空干燥5min;最后用6mL甲醇以1mL·min-1的流速将目标物质从SPE-HLB小柱上洗脱下来，收集洗脱液;
(3)在水浴温度40℃以高纯氮气将洗脱液吹至近干，加入乙腈和水的混合液定容， 然后用0.22μm的针头式过滤器过滤;
(4)将步骤(3)得到的液体进行HPLC-MS/MS分析，分析条件如下：
a高效液相色谱条件：
色谱柱：C8液相色谱柱
流动相：A相为乙腈：B相为含0.28%甲酸的高纯水;
流速：0.4mL·min-1;
进样量：20μL;
柱温：40℃;
b串联质谱条件：
离子源：电喷雾电离源正离子模式;
检测方式：多反应监测离子模式;
毛细管电压：3.5kV;干燥气为：250℃。
2.根据权利要求1所述的一种测定污泥中痕量四环素、土霉素和金霉素含量的方法， 其特征在于：步骤(1)中所述的EDTA-Mcllvaine缓冲提取液具体为：0.05mol·L-1EDTA、 0.06mol·L-1Na2HPO4、0.08mol·L-1柠檬酸，pH=4。
3.根据权利要求1所述的一种测定污泥中痕量四环素、土霉素和金霉素含量的方法， 其特征在于：步骤(3)中所述的乙腈和水的混合液中乙腈与水的体积比7：3。
4.根据权利要求1所述的一种测定污泥中痕量四环素、土霉素和金霉素含量的方法， 其特征在于：步骤(4)中所述的流动相A和流动相B的体积比为70：30。
说明书
一种测定污泥中痕量四环素、土霉素和金霉素含量的方法
技术领域
本发明属于抗生素的痕量检测领域，特别涉及一种测定污泥中痕量四环素、土霉素和 金霉素含量的方法。
背景技术
随着生物医药技术的发展，各种各样的药品为人类的健康生存和发展作出了巨大的贡 献。目前约有3000余种不同的药品在世界各国普遍使用，包括各种抗生素、避孕药、油脂 调节剂、抗抑郁症药和生长抑制剂等。其中，四环素类药品是广泛应用于临床的一类广谱 十二氢化并四苯抗生素，包括金霉素、土霉素、四环素及近年来发展起来的半合成四环素 类抗生素(多西环素、米诺环素、吡咯烷甲基四环素、甲烯土霉素、甲氯环素等)，这类 药品主要用于牙周炎、上呼吸道感染、扁挑体炎、糖尿病以及动物饲料添加剂等。通常这 些四环素类抗生素只能部分被人体或动物吸收转化，剩余大部分药品及其代谢物随尿液和 粪便排泄，并通过城市下水道进入到城市污水处理系统中，由于这些物质的亲脂性，它们 中的大部分被吸附在污泥上。随着污泥中微量污染物问题被不断提出，对这些抗生素的检 测就越来越重要，而抗生素的检测方法成为相关研究的重要因素。
通常的对污泥中的四环素、土霉素和金霉素的液相色谱法测定中，如何从污泥中萃取 并分离鉴别这些物质，对HPLC检测有很大的影响。选择使用超声萃取+固相萃取/高效液相 色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)进行污泥中四环素类抗生素的定量检测，并选择多反应监 测离子模式(MRM)，以求检测污泥中四环素、土霉素和金霉素。高效液相色谱-串联质谱 法(HPLC-MS/MS)的特异性和选择性强，其多反应监测(MRM)模式可以通过检测分 子离子和碰撞诱导解离得到的碎片离子，而更有选择性地定性定量检测目标化合物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种测定污泥中痕量四环素、土霉素和金霉素含量 的方法，该方法中痕量四环素、土霉素和金霉素的色谱图出峰稳定，峰形良好，出峰的拖 尾现象消除，并能得到准确的结果。
本发明的一种测定污泥中痕量四环素、土霉素和金霉素含量的方法，包括：
(1)将污泥样品于8000r·min-1离心10min后，将其中的污泥固体真空冷冻干燥，然 后捣碎并过50目筛，接着准确称量1.000g筛后污泥并置于离心管中，加入10ml EDTA-Mcllvaine缓冲提取液漩涡混合1min后超声萃取10min，并以4000r·min-1离心20 min后，收集上清液;再重复萃取2次，合并3次萃取的上清液;
(2)依次用6mL甲醇、6mL高纯水、6mL Na2EDTA的缓冲液对SPE-HLB小柱进行 活化和平衡，而后以3mL·min-1的流速将合并后的上清液缓缓流经SPE-HLB小柱，全部萃 取后用6mL高纯水清洗小柱，接着真空干燥5min;最后用6mL甲醇以1mL·min-1的流速 将目标物质从SPE-HLB小柱上洗脱下来，收集洗脱液;
(3)使用氮吹仪在水浴温度40℃以高纯氮气将洗脱液吹至近干，加入乙腈和水混合 液定容，然后用0.22μm的针头式过滤器过滤;
(4)将步骤(3)得到的液体进行HPLC-MS/MS分析，分析条件如下：
a高效液相色谱条件：
色谱柱：C8液相色谱柱(美国Phenomenex公司);
流动相：A相为乙腈：B相为含0.28%甲酸的高纯水;
流速：0.4mL·min-1;
进样量：20μL;
柱温：40℃;
b串联质谱条件：
离子源：电喷雾电离源正离子模式(ESI+);
检测方式：多反应监测(MRM)离子模式;
毛细管电压：3.5kV;干燥气为：250℃。
步骤(1)中所述的EDTA-Mcllvaine缓冲提取液具体为：0.05mol·L-1EDTA、0.06mol·L-1Na2HPO4、0.08mol·L-1柠檬酸，pH=4。
步骤(3)中所述的乙腈和水的混合液中乙腈与水的体积比7：3。
步骤(4)中所述的流动相A和流动相B的体积比为70：30。
本发明中采用超声萃取和固相萃取泥样中四环素、土霉素和金霉素;用HPLC-MS/MS 和外标法计算四环素、土霉素和金霉素的含量。
在样品制备时，本发明采用了超声萃取泥中四环素、土霉素和金霉素到液体中，超声 萃取具有较高的分离效果，能够有效萃取污泥中的物质。
有益效果：
(1)本发明分别获得了对测定污泥中痕量四环素、土霉素和金霉素含量的高效液相 色谱法有重要影响的几个条件：柱温、流动相配比和流速等，并考察了回归方程、相关系 数及线性范围，获得较好的精密度与加标回收率;
(2)本发明采用高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)的多反应监测(MRM) 模式和C8反相硅胶色谱柱，采用了超声萃取和非极性萃取柱联合的泥相萃取方法，使用乙 腈/超纯水为流动相，恒速洗脱，通过对超纯水pH与流动相配比的调整，使分析方法中痕 量四环素、土霉素和金霉素的色谱图出峰稳定，峰形良好，出峰的拖尾现象消除，并能得 到准确的结果。
