申请日2009.09.18
公开(公告)日2010.04.07
IPC分类号C12N11/04; C12R1/085; C02F3/34
摘要
本发明涉及蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)微生物制剂及其制备方法，所述蜡状芽孢杆菌保藏编号为CGMCC No.3047，其步骤如下：利用琼脂和聚乙烯醇将蜡状芽孢杆菌CGMCC No.3047进行固定化，并通过20-60℃气流干燥最终制成生物菌剂。该制备方法中琼脂和聚乙烯醇的使用量少，生产成本低，制备方法简单;该方法制成的生物菌剂微生物活性高、易保存、运输方便，容易回收;利用此菌剂处理含氮废水，在NH4+-N初始浓度在100mg/L、NO3--N初始浓度在30mg/L的条件下，NH4+-N的去除率达到93.7%，TN(废水中NH4+-N、NO3--N和NO2--N浓度之和)的去除率达到88.6%;该法的另一特点是，该菌株可同时去除NH4+-N、NO3--N和NO2--N。因此，鉴于以上特点，此方法不仅适用于各种城市及生活废水，也适用于高浓度氨氮工业废水的脱氮治理。
权利要求书
1.蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)用于制备生物脱氮用微生物制剂的用途，其特征在于，所述蜡状芽孢杆菌保藏编号为CGMCC No.3047。
2.一种用于处理含氮废水的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂包括蜡状芽孢杆菌CGMCC No.3047。
3.权利要求2所述微生物制剂的制备方法，其特征在于，具体步骤为：
(1)配制琼脂和聚乙烯醇的混合液，琼脂和聚乙烯醇之间的质量比是1∶2～6;与蜡状芽孢杆菌CGMCC No.3047菌液混合后终浓度为质量1%～4%和2%～8%;将混合液121℃条件下灭菌20min，待混合液冷却至室温;
(2)将对数生长期的蜡状芽孢杆菌CGMCC No.3047菌悬液加入琼脂和聚乙烯醇混合液中搅匀，菌悬液与混合液为1∶50的体积百分比，菌悬液的菌体浓度为40%～50%，再将混合液用针管型枪注入已灭菌饱和硼酸中，形成小球，此过程中，操作温度需控制在30～70℃;
(3)将小球在0～5℃交联8-32小时，用无菌水洗净0～5℃保存待用;
(4)把固定化好的小球放入干燥箱中，20～60℃干燥5～40h取出，用自封袋包装，放入CaCl2作为干燥剂。
4.权利要求3制备的微生物制剂处理含氮废水的方法，其特征在于，将菌剂加入含氮废水中，培养反应4天，其条件是转数为100～200r/min;DO=4.2～6.7mg/L、温度20～40℃、pH为7～9、C/N为15～35;菌剂质量∶含氮废水质量=1∶200～1000。
说明书
蜡状芽孢杆菌微生物制剂和该制剂处理含氮废水的方法
技术领域
本发明涉及一株具有脱氮性能的蜡状芽孢杆菌，及由该菌株制备的微生物制剂和利用该微生物制剂处理含氮废水的方法，属于微生物领域。
背景技术
传统的废水脱氮方法中，氨氮需经过硝化菌转变为硝基氮，再通过反硝化菌将水中的硝基氮还原成气态，从水中排除。但是近年来，有不少文献报道发现了一些反硝化菌同时兼具硝化性能，这种菌可以将氨氮直接转变成氮的气态形式将氮从水体中直接排出。这种菌具有很高的利用价值，在废水脱氮中可以减少脱氮步骤，节省时间，提高处理效率。
发明人早期专利“具有好氧反硝化性能的戴尔福特菌及其处理废水的方法”ZL 200610140872.3，该专利是一种涉及采用戴尔福特(Delftia tsuruhatensis)WXZ-9 CGMCC No.1797菌株在好氧条件下进行生物脱氮处理废水的方法。发明专利“具有好氧反硝化性能的睾丸酮丛毛单胞菌及其处理废水的方法”ZL200610140870.4，该专利是一种涉及采用睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonastestosteroni)WXZ-18 CGMCC No.1800菌株及其应用于废水脱氮处理的方法。发明专利“具有好氧反硝化性能的恶臭假单胞菌及其处理废水的方法”ZL200610140871.9，该专利是一种涉及采用恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)WXZ-4 CGMCC No.1798菌株及其应用于废水脱氮处理的方法。发明专利“具有好氧反硝化性能的草螺菌及其处理废水的方法”ZL 200610140869.1，该专利是一种涉及采用草螺菌(Herbaspirillum huttiense)WXZ-14 CGMCC No.1799菌株及其应用于废水脱氮处理的方法。这四项专利所涉及的这些菌株具有优异的好氧反硝化性能，可以去除废水中的硝基氮和亚硝基氮。异养硝化作用(heterotrophicnitrification)是异养微生物参与无机氮氧化的生物化学过程，它的底物是无机态氨氮。近年来，有研究者提出更为严格的异养硝化作用的定义为(Papen，1998)：异养微生物在好氧条件下将氨/铵或是有机态氮氧化到羟胺，亚硝酸盐和硝酸盐的过程，即：
目前国外的研究报道中尚未见芽孢杆菌异养硝化-好氧反硝化的报道，但国内已有了相关的研究。郝桂玉研究了SBR中芽孢杆菌的异养硝化作用，指出SBR周期连续运行后，污泥浓度会相对稳定，芽孢杆菌能很好适应好氧与缺氧环境，成为污泥中的优势菌种。但在驯化过程中，进水氨氮浓度在20mg/L左右，且最大氨氮去除率低于60%，但未指出究竟是否有脱氮功能，因此不能判断是否存在好氧反硝化性能。于爱茸从鱼塘中分离到1株高效的有氧反硝化菌Bacillus sp.W2，经Biolog法细菌鉴定，初步鉴定为芽孢杆菌。该菌在硝基氮浓度为25mg/L，溶解氧达到2mg/L时，除氮率达到97%;溶解氧达到4~5mg/L时，除氮率为85%以上;同时在好氧条件下，菌体浓度为1000个/mL时，对自然水体中高达1mg/L亚硝酸浓度也能发挥高效的反硝化作用，但未见Bacillus sp.W2菌株的异养硝化性能的相关研究报道。何霞等从膜生物反应器中分离出来的1株异养硝化细菌Bacillus sp.LY，经鉴定为芽孢杆菌。在氨氮浓度分别为40、80和120mg/L 3种情况下，120h反应后，氨氮的去除率分别是100%、85.7%、73.7%。该菌株的硝化作用启动慢，在120h才能达到较好的脱氮效果。并报道经研究Bacillussp.LY具有脱氮性能，但未指出总氮去除率。
但是在实际工程中，实验室筛选的优良菌株受运输及保存条件、保存时间等限制，影响广泛使用。采用菌株固定化可以解决这一问题，菌株固定化是利用物理、化学等因素将菌种约束或限制在一定的空间介质内(上)，而菌种仍保留其催化活性，并具有能被反复或连续使用的活力。固定化后的菌种只要通过常温干燥保存可保存数月，并且运输方便，可以回收。
综上所述具有异养硝化-好氧反硝化作用的高效脱氮菌如做成菌剂产品，将对废水脱氮市场产生重要意义。
现有菌剂的包埋材料主要为天然多糖类凝胶和有机合成高分子凝胶两类。常见的天然高分子凝胶主要有：海藻酸钠、卡拉胶、琼脂等;常见的有机高分子凝胶主要有：聚乙烯醇、聚丙烯酰胺等。两类凝胶各有优缺点，天然高分子凝胶其优点是制作过程简单，易成球，包埋剂对微生物活性影响小，其缺点是抗微生物分解能力差，机械强度较低;有机合成高分子凝胶的优点是，机械强度高，抗微生物分解能力强，但其缺点是制作过程复杂，有些凝胶易粘连，且对微生物活性影响较大。因此，目前的研究表明，只有两种或多种包埋剂联合使用，才能发挥其各自的优点，弥补彼此的缺点。
以发明人叶正方、李沧海、李三喜的“固定化微生物处理污水工艺”CN1405099A是关于利用改性泡沫吸附优势菌株的发明专利，并且此专利并没有提到保存时间，且该发明只提到了氨氮的去除，并没有提到总氮的去除。
以发明人罗明芳、刘会洲等的“利用海藻酸钙固定化德氏假单胞菌R-8进行油品脱硫的方法”CN1458229A是以海藻酸钠为包埋剂的发明专利，以氯化钙为交联剂，将德氏假单胞菌固定化，但此法主要是用于油品脱硫菌的包埋方法。
文献“不同材料包埋固定化厌氧氨氧化混培物”报道了(朱刚利等，2008)分别采用羧甲基纤维素钠(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、海藻酸钠(SA)以及PVA-SA混合液，对ANAMMOX混培物进行了包埋固定化和基本性能测试，四种包埋方法氨氮去除率均达到了90%以上，但均有硝酸盐积累现象，积累值均达到25mg/L。
文献“亚硝酸盐氧化细菌固定化方法的优化研究”(崔华平等，2009)报道了采用聚乙烯醇和海藻酸钠混合固定亚硝酸盐氧化细菌，得到最佳包埋条件为：聚乙烯醇8%、海藻酸钠1%、包埋菌液浓度26g/L、固定化小球交联时间16h，10d内将亚硝酸盐氮从1.210mg/L降至0.041mg/L。
文献“改性载体固定化微生物处理高氨氮废水的研究”(李彦锋等，2008)报道了采用改性聚氨酯泡沫体作为固定化高效微生物载体，在初始氨氮500mg/L条件下，氨氮去除率可达97.75%，但此文并没有提到总氮去除率。
文献“聚乙烯醇作为固定化细胞包埋剂的研究”(李峰等，2000)报道了以聚乙烯醇为包埋剂对活性污泥进行固定化，以固定化细胞的CODCr去除率为包埋效果的主要指标，并对固定化细胞的保存进行了试验研究。利用合成废水浸泡(4℃)保存十天后，经过十天的活化其CODCr仍不到70%。
迄今尚未见有关采用聚乙烯醇和琼脂作混合包埋剂的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一株以硝酸盐或氨氮为氮源进行生长的菌株;并将其制成菌剂，菌剂的制作和干燥过程简单，接种于常规好氧污泥中，即可实现含氨氮废水的直接脱氮作用。可以解决传统废水处理中脱氮需要利用不同的硝化和反硝化菌群，更不需要反硝化在缺氧环境、硝化在好氧环境分段处理的问题;也解决了优良菌株工程应用不易保存、运输困难，菌剂生产过程复杂，生产成本过高等诸多问题。
本发明的发明思路是采用已筛选的具有天然生长优势的高效异养硝化-好氧反硝化菌株，根据现有菌株包埋技术的缺陷，发明人利用琼脂和聚乙烯醇的结合，在制作过程、包埋后微生物活性、以及传质效果等方面改进了现有技术在菌剂包埋方面的问题。将包埋菌剂接种于不同浓度的氨氮废水中，并通过不同反应条件试验(溶解氧，碳氮比，pH等)，证实菌剂在简单保存条件下有良好的活性，具有广泛的应用适应性。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株具有异养硝化-好氧反硝化性能的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，于2009年4月30日，保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No.3047。
上述的蜡状芽孢杆菌CGMCC No.3047用于制备生物脱氮用微生物制剂的用途。
一种用于处理含氮废水的微生物制剂，所述微生物制剂包括蜡状芽孢杆菌CGMCC No.3047。
上述微生物制剂的制备方法，其具体步骤为：
(1)配制琼脂和聚乙烯醇的混合液，琼脂和聚乙烯醇之间的质量比是1∶(2～6);与蜡状芽孢杆菌CGMCC No.3047菌液混合后终浓度为1%～4%和2%～8%，121℃条件下灭菌20min，待混合液冷却至室温;
(2)将对数生长期的蜡状芽孢杆菌CGMCC No.3047菌悬液，菌悬液与混合液为1∶50的体积百分比，菌悬液的菌体浓度为40%～50%(质量百分比)，再将混合液用针管滴入已灭菌饱和硼酸中，形成小球。此过程中，操作温度需控制在30～70℃;
(3)将小球放入冰箱中0～5℃交联8～32小时，用无菌水洗净0～5℃保存待用;
(4)把固定化好的小球放入干燥箱中，20～60℃干燥5～40h取出，用自封袋包装，放入CaCl2作为干燥剂，菌剂制备完成。
利用上述微生物制剂处理含氮废水的方法，将菌剂(菌剂质量∶含氮废水质量=1∶(200～1000))加入含氮废水中，摇床振荡培养4天，其条件是转数为100～200r/min、温度20～40℃、pH为7～9、C/N为15～35。
本发明的优点及有益效果是：
1、本发明蜡状芽孢杆菌兼具异养硝化和好氧反硝化性能，异养硝化要比传统自养硝化菌的硝化反应速度快得多，在本案例中，甚至快于反硝化速度;好氧反硝化菌和传统缺氧反硝化菌相比，可以和硝化同时进行，在本案例中，单菌株就实现硝化和反硝化过程。
2、本发明菌株除了具有异养硝化和好氧反硝化性能外，还具有特殊的生物N2O控逸作用，在以柠檬酸三钠为唯一碳源，硫酸铵为唯一氮源，温度=30℃，C/N=25，pH=9.0，转数=180r/min(DO=5.76～6.59mg/L)，NH4+-N初始浓度分别为100mg/L条件下，空气密封培养96h后，NH4+-N和TN去除率分别达到96.3%和93.81%，产生的N2O气体为0.00945mg，N2为9.5005mg，仅占从水体中脱除的氮的0.047%;
3、本发明制备的微生物制剂能实现含氮废水的同步硝化反硝化，可以解决传统废水处理中脱氮需要采取缺氧反硝化，好氧硝化分段处理的问题。在温度=20～40℃，C/N=15～35，pH=7～9，转数=100～200r/min，初始NH4+-N和NO3--N浓度分别达到100mg/L和30mg/L条件下，NH4+-N和TN去除率分别达到93.7%和88.6%。
4、本发明微生物制剂制备方法简单，成本低廉、生物活性高、易保存、运输方便，容易回收。该微生物制剂在干燥密封的保存条件下可以至少保存三个月，且活性不受影响，经实验室验证，本发明制备菌剂干燥保存90天的NH4+-N和TN去除率可分别达到89.1%和84.2%。此微生物制剂不仅适用于各种城市及生活废水，也适用于高浓度氨氮工业废水的治理。
5、本发明的包埋材料选择和包埋方法，使微生物制剂小球易于保存，在运输和使用过程中不易破碎，并且可以保证微生物的活性不受影响。
