申请日2005.12.09
公开(公告)日2006.08.30
IPC分类号C12Q1/68
摘要
本发明涉及一种污水中细菌的基因芯片检测方法。本发明该方法步骤包括：目的细菌的选择、根据所选取的不同目的细菌的特征基因作为芯片检测的靶基因，针对不同细菌的特定基因分别设计PCR引物和种、属检测探针、根据所设计的检测探针，制备基因芯片、目的细菌的DNA的抽提、PCR扩增反应、PCR扩增反应产物的杂交、杂交后的产物清洗、干燥后扫描。本发明根据所选取的不同细菌的特征基因作为芯片检测的靶基因，针对不同细菌的特定基因分别设计PCR引物和种、属检测探针，所设计的引物具有良好的特异性，对目的细菌扩增效果良好，无非特异性扩增。纯细菌DNA的抽提方法简单易行，2h内即可抽提目的细菌的DNA且得率较高;PCR扩增和杂交方法、条件易于实施，杂交检测结果稳定，有利于该技术的实际应用。
权利要求书
1.一种污水中细菌的基因芯片检测方法，其特征在于该方法的具体步骤如下：
a.目的细菌的选择;
b.所选细菌的特异引物和种、属检测探针的设计：根据所选取的不同目的细菌 的特征基因作为芯片检测的靶基因，针对不同细菌的特定基因分别设计PCR引 物和种、属检测探针;
c.根据所设计的检测探针，制备基因芯片;
d.目的细菌的DNA的抽提;
e.PCR扩增反应：用所抽提的目的细菌的DNA作为PCR扩增反应的模板，进行线 性扩增：
f.PCR扩增反应产物的杂交：按以下配方配制杂交体系进行杂交，
试剂 体积
6×杂交液 2μ
Cy3(生物素) 1μl
SACy3 1μl
其中，杂交液的为：20×SSC 30ml，50×Denhart’s 10ml，10%SDS 5ml，
10mg/ml Salmon DNA 1ml，去离子水54ml，充分混匀后，用0.45um滤膜去杂质;
g.杂交后的产物清洗、干燥后扫描。
2.根据权利要求1所述的污水中细菌的基因芯片检测方法，其特征在于所述的目的 细菌为肠球菌、肺炎克雷白菌、荧光绿脓杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌、大肠0-157 和大肠杆菌;所述的PCR引物为：
细菌名称 引物名称 序列
大肠0-157 EC-hlyA-F3 AAGCCGGAACAGTTCTCTCA
EC-hlyA-R3B Biotin-CACTTGCAGCTGTTGTCGAT
沙门氏菌 Sa-InvA-F3 AGCCGCTCAGTATTGAGGAA
Sa-InvA-R3B Biotin-GTTGTACCGTGGCATGTCTG
志贺氏菌 Sh-IpaH-F4 CTTTCCGATACCGTCTCTGC
Sh-IpaH-R4B Biotin-CAGTCTCACGCATCACCTGT
大肠杆菌 EC-CadC-F3 TTTTCTGCTCTCGCGTAGGT
EC-CadC-R3B Biotin-AGCTGGCGATTCAAAATGAT
肠球菌 Ent-F2 TTGATGGTCCTATGCCTCAAA
Ent-R2B Biotin-CGATTTCAACTTCGTCACCA
肺炎克雷白菌 KP16S-F AGCGGTAGCACAGAGAGCTTG
KP16S-RB Biotin-CCCACTTTGGTCTTGCGAC
荧光绿脓杆菌 OprI-F2 GGGGAGATTGCTGTTATGGA
OprI-R2B Biotin-TATTACTTGCGGCTGGCTTT
细菌通用 23SRNA-FB Biotin-CGGCGGCCGTAACTATAAC
23SRNA-R AGACCGCCCCAGTCAAAC;
所述的种、属检测探针为：
探针名称 序列 长度
EHEC-HlyA-R3TPN NH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTT
GCAATTATTCTGGCTCAGAGAATGGCACAGGGGTT 36
ST-InvA-R3TPN NH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTT
AACTGGAAGCGAAATTTCCTGATTTACTTAAAGAAGTGCT 40
Shig-ipaH-R4TPN NH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTT
GGATGCGCAGAGGGAAGCCGGTGC 24
EC-CadC-R2TPN NH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTT
GATGATTGAACAATCTCACCTAATAATTCACTGGCACGA 40
Ent-P NH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTT
TCTCAATCACTGGACGTGGTACTGTTGCTAC 32
KP16S-P NH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTT
CGGGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAAT 31
PS-OprI-RTPN NH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTT
GGCTAACGAGCGTGCCCTGCGCATG 25
23SRNA-FTPN NH2-(C6)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTT
GACAAGGAATTTCGCTACCTTAGGACC 27
探针的浓度为10μmol/l。
3.根据根利要求1所述的污水中细菌的基因芯片检测方法，其特征在于所述目的细 菌的DNA的抽提的方法为：
A.将污水中的细菌进行微生物培养;
B.将培养出的菌株接种于LB液体培养基中，摇床培养16h后，吸取培养液500μl 于1.5ml的离心管中;
C.将离心管置于100℃水浴锅中15分钟左右，加速细胞的破裂，有助于提高DNA 抽提的效率;
D.取出离心管，室温下放置5min左右使变性的DNA复性，加入1000μl的细胞 裂解液：异硫氰酸胍CH5N3·CHNS 47.264g，醋酸钠C2H3O2Na·3H2O 1.36g， N-Lauroylsarosine Sodium Salt 0.2g，异丙醇C3H8O 17ml，以双蒸水定容 至100ml，放置20分钟，加入之后要用震荡器震荡完全，使细胞壁能够完全 裂开，核酸和蛋白质将保留在溶液里;
E.4℃、13000rpm离心5分钟，使细胞碎片可以沉淀下来除去;
F.取含DNA的上清液800μl加入到二分之一体积即400μl的冰无水乙醇于-20 ℃中，再剧烈震荡，使之充分混合，否则会出现结晶;然后放置在-20℃的 冰箱中20分钟或者过夜，使溶液中的DNA能充分沉淀;
G.取出，以15000rpm的速度在4℃下离心20分钟;这时在离心管底部可以看 见白色的DNA沉淀;
H.小心倒去上清，注意不能回流，可用40度左右的温度烘干剩余的无水乙醇; 溶解沉淀的DNA，控制DNA的浓度为0.2-2μmol/l。
4.根据根利要求1所述的污水中细菌的基因芯片检测方法，其特征在于所述的扩增 反应体系为：
试剂 体积，50μl
10×PCR Buffer，Mg2+Free 5μl
Mgcl2 25mM 3μl
DNTP 10mM 1μl
rTaq 2500U，5U/μl 0.25μl
引物 2μl
模板 2μl
灭菌水 36.75μl;
所述的扩增反应条件为：
步骤 温度(℃) 时间 返回 循环数
初始DNA变性 94℃ 3min
变性 94℃ 30sec
退火 54℃ 1min
延伸 72℃ 1min 步骤2 35
变性 94℃ 30sec
退火 52℃ 30sec 步骤5 5
保留 4℃ Forever。
说明书
污水中细菌的基因芯片检测方法
技术领域
本发明涉及一种细菌的基因芯片的检测方法，特别是一种污水中细菌的基因芯片 检测方法。
背景技术
在现有技术中，污水中细菌的检测主要是利用传统微生物学方法、生物化学方法、 血清学方法和PCR方法(Santiago F.Gonzalez，Melissa J.Krug，Michael E.NIelsen，et al.2004;Call，D.，M.Borucki，and T.Besser.200)。这些方法有一些 限制：(1)由于需要培养，所需时间长;(2)不能区别亲缘关系相近的细菌;(3)不能 鉴定未知的细菌;(4)交差反应和其他假阳性;(5)灵敏度问题(假阴性)。而利用基因 芯片技术快速检测细菌对环境、人体、动植物的污染和危害，可高效地探测到由细菌 引起的污染，还能帮助研究人员找到并合成具有解毒和消化污染物功能的天然酶基 因。我们都知道，环境的变化会引起细胞发生基因表达水平的变化，基因芯片是高效 的监测基因表达变化的手段。所以，国外许多实验室纷纷探索用DNA微阵列技术监测 环境污染和提高环境保护技术水平。
与传统方法相比，基因芯片技术的先进性主要体现在：(1)基因芯片可以对污水 中细菌实现高通量、并行检测，一次实验即可得出多个结果;能提高测试样品数量5～ 10倍，另外测试成本能下降约10倍;(2)操作简便、快速，整个检测在数小时内可 以完成，而传统的方法一般需要4～7天的时间;(3)特异性强、敏感性高，可以检测 污水中常见的致病菌;(4)可以区分到细菌的属和种。目前多数基因芯片研究中大都 在16SrRNA恒定区中设计细菌通用引物，在可变区设计检测探针，虽然可以通过一次 PCR反应将所有细菌的相应基因片段扩增出来，但是由于肠道致病菌(沙门氏菌、支 贺氏菌和大肠杆菌等)探针所在的16SrRNA序列基本相同，所以只能作为一类细菌被 检出。
发明内容
本发明的目的在于提供一种污水中细菌的基因芯片检测方法，该方法以不同细菌 的特征基因作为芯片检测的靶基因，针对不同细菌的特定基因分别设计PCR引物和 种、属检测探针，所设计的引物对目的细菌具有良好的扩增效果，无非特异性扩增。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种污水中细菌的基因芯片检测方法，其特征在于该方法步骤如下：
a)目的细菌的选择;
b)所选细菌的特异引物和种、属检测探针的设计：根据所选取的不同目的细菌 的特征基因作为芯片检测的靶基因，针对不同细菌的特定基因分别设计PCR 引物和种、属检测探针;
c)根据所设计的检测探针，制备基因芯片;
d)目的细菌的DNA的抽提;
e)PCR扩增反应：用所抽提的目的细菌的DNA作为PCR扩增反应的模板，进行 线性扩增：
f)PCR扩增反应产物的杂交：按以下配方配制杂交体系，混匀，避光备用，
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| 其中，杂交液的为：20×SSC 30ml，50×Denhart's 10ml，10％SDS 5ml，10mg/ml Salmon DNA 1ml，去离子水54ml，充分混匀后，用0.45um滤膜去杂质； | ||||||||||||||||||||||||||||
| g.杂交后的产物清洗、干燥后扫描。 | ||||||||||||||||||||||||||||
上述的目的细菌为：肠球菌、肺炎克雷白菌、荧光绿脓杆菌、志贺氏菌、沙门氏 菌、大肠O-157和大肠杆菌；所述的PCR引物为：
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所述的种、属检测探针为：
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探针的浓度为10μmol/l。
所述目的细菌的DNA的抽提的方法为：
1.将污水中的细菌进行微生物培养;
2.将培养出的菌株接种于LB液体培养基中，摇床培养16h后，吸取培养液500μl 于1.5ml的离心管中;
3.将离心管置于100℃水浴锅中15分钟左右，加速细胞的破裂，有助于提高DNA 抽提的效率;
4.取出离心管，室温下放置5min左右使变性的DNA复性，加入1000μl的细胞 裂解液：异硫氰酸胍CH5N3·CHNS 47.264g，醋酸钠C2H3O2Na·3H2O 1.36g， N-Lauroylsarosine Sodium Salt 0.2g，异丙醇C3H8O 17ml，以双蒸水定容 至100ml，放置20分钟，加入之后要用震荡器震荡完全，使细胞壁能够完全 裂开，核酸和蛋白质将保留在溶液里;
5.4℃、13000rpm离心5分钟，使细胞碎片可以沉淀下来除去;
6.取含DNA的上清液800μl加入到二分之一体积即400μl的冰无水乙醇于-20 ℃中，再剧烈震荡，使之充分混合，否则会出现结晶;然后放置在-20℃的 冰箱中20分钟或者过夜，使溶液中的DNA能充分沉淀;
7.取出，以15000rpm的速度在4℃下离心20分钟;这时在离心管底部可以看 见白色的DNA沉淀;
8.小心倒去上清，注意不能回流，可用40度左右的温度烘干剩余的无水乙醇; 溶解沉淀的DNA，控制DNA的浓度为0.2-2μmol/l.
上述的扩增反应体系为：
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所述的扩增反应条件为：
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本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：本 发明根据所选取的不同细菌的特征基因作为芯片检测的靶基因，针对不同细菌的特定 基因分别设计PCR引物和种、属检测探针，所设计的引物具有良好的特异性，对目的 细菌扩增效果良好，无非特异性扩增。纯细菌DNA的抽提方法简单易行，2h内即可 抽提目的细菌的DNA且得率较高;PCR扩增和杂交方法、条件易于实施，杂交检测结 果稳定，有利于该技术的实际应用。本发明方法基于基因芯片技术的检测方法体现出 了高通量、高效率、并行化处理的特点，对于一份食品工业污水水样，可以在4h之 内完成目的菌种的检测。这种检测技术为以后更大规模的检测研究奠定了良好的技术 基础，可以推广应用于环境监测、食品卫生监督、商品检验检疫等许多领域。
