申请日2004.03.24
公开(公告)日2005.01.12
IPC分类号C12N1/20; C02F3/34
摘要
本发明涉及一种用于工业废水或海水生化需氧量传感器测量菌株-地衣芽孢杆菌的培养方法。本发明从淀粉厂生产废水中筛选分离得到一株高呼吸强度的好氧菌株，并通过驯化该菌株可作为工业废水或海水BOD生物传感器中的工作菌株。该驯化菌株的特点是对碳水化合物和有机物有广普降解作用，耐盐，能满足工业废水或海水BOD传感器对菌株的需要。将其固定后置于BOD传感器探头即氧电极上，响应信号大、灵敏度高、线性关系好。本发明的有益效果如下：利用本发明培养驯化的菌株经过固定化后用于测定生活污水、食品厂工业废水、污水处理厂出水、焦化厂工业废水、炼油厂工业废水及海水，其测定精密度高，测定值与BOD5有很好的相关性。
权利要求书
1、一种用于工业废水生化需氧量传感器测量菌株—地衣芽孢杆 菌的培养方法，其特征在于：
(1)从淀粉厂生产废水中筛选分离地衣芽孢杆菌：
a、配制固体培养基：
以淀粉厂生产废水作为培养基的配制水源配制固体培养 基;
b、用淀粉厂生产废水作为菌源均匀涂于固体平板上，于28 -32℃的培养箱中培养;在平板上长出菌落后，挑出菌落大、生长迅 速的一株菌，于上述a项固体培养基成分的不加琼脂的液体培养基中 进行扩大培养，摇床转速为130-160转/分钟，培养温度为28-32 ℃，待有菌长出后，连续转接2-3代，每代12-24小时，获得地衣 芽孢杆菌菌株;
(2)对上述地衣芽孢杆菌菌株进行逐步驯化：
a、利用所要测定的工业废水代替第(1)步中a项的淀粉厂 生产废水作为培养基的配制水源配制液体培养基，首先，使用含10% 的上述所要测定的工业废水的蒸馏水作为配制水源配制液体培养基， 于121℃高压灭菌25分种;
b、将上述地衣芽孢杆菌菌株放入培养箱中培养，温度为28 -32℃，摇床转速为130-160转/分钟，待有菌长出后，转接到含20% 的上述所要测定的工业废水配制的液体培养基中继续培养1-3代， 直至有菌明显长出;培养条件为温度28-32℃，摇床转速为130-160 转/分钟;
c、再按上述第(2)步第b项的方法依次在含40%、60%、 80%、100%的上述所要测定的工业废水配制的液体培养基中进行培养 1-3代;
d、最后再按上述第c项的方法在用100%的上述所要测定的 工业废水配制的液体培养基中进行培养3-4代，从而完成该菌的驯 化过程：
2、根据权利要求1所述的用于工业废水生化需氧量传感器测量 菌株—地衣芽孢杆菌的培养方法，其特征在于所述的固体培养基按以 下组分配制：
牛肉膏0.5克、蛋白胨0.5克、可溶性淀粉0.5克、氯化镁0.1 克、琼脂1.5克、淀粉厂生产废水100毫升;调节PH值为6.8-7.2， 121℃高压灭菌25分钟。
3、一种用于海水生化需氧量传感器测量菌株—地衣芽孢杆菌的 培养方法，其特征在于：
(1)从淀粉厂生产废水中筛选分离地衣芽孢杆菌：
a、配制固体培养基：
以淀粉厂生产废水作为培养基的配制水源配制固体培养 基;
b、用淀粉厂生产废水作为菌源均匀涂于固体平板上，于28 -32℃的培养箱中培养;在平板上长出菌落后，挑出菌落大、生长迅 速的一株菌，于上述a项固体培养基成分的不加琼脂的液体培养基中 进行扩大培养，摇床转速为130-160转/分钟，培养温度为28-32 ℃，待有菌长出后，连续转接2-3代，每代12-24小时，获得地衣 芽孢杆菌菌株;
(2)对上述地衣芽孢杆菌菌株进行逐步驯化：
a、液体驯化培养基：
以蒸馏水作为培养基的配制水源配制液体驯化培养基;
b、将上述地衣芽孢杆菌菌株接入添加1%Nacl的液体驯化 培养基中培养并转接2-3代，每代12-24小时，培养条件为温度 28-32℃，摇床转速为130-160转/分钟;
c、按照上述b项方法依次在添加2%、3%、4%、5%NaCL的上述液体驯化培养基中培养驯化;
d、最后按上述第c项的方法在用纯海水配制的液体驯化培 养基中再进行培养并转接3-5代，从而完成该菌的海水驯化过程。
4、根据权利要求3所述的用于海水生化需氧量传感器测量菌株 —地衣芽孢杆菌的培养方法，其特征在于所述的固体培养基按以下组 分配制：
牛肉膏0.5克、蛋白胨0.5克、可溶性淀粉0.5克、氯化镁0.1 克、琼脂1.5克、淀粉厂生产废水100毫升;调节PH值为6.8-7.2， 121℃高压灭菌25分钟。
5、根据权利要求4所述的用于海水生化需氧量传感器测量菌株 —地衣芽孢杆菌的培养方法，其特征在于所述的液体驯化培养基按以 下组分配制：
牛肉膏0.5%、蛋白胨0.5%、可溶性淀粉0.5%、氯化镁0.1%、 蒸馏水;调节PH值为6.8-7.2，121℃高压灭菌25分钟。
说明书
用于工业废水或海水生化需氧量传感器测量菌株—地衣芽孢杆菌的培养方法
技术领域
本发明涉及一种用于工业废水或海水生化需氧量传感器测量菌株 —地衣芽孢杆菌的培养方法。
技术背景
水体的“生化需氧量(BOD)”是衡量水质是否被有机物污染及其 污染程度的主要指标之一。目前国内外测定该指标的方法均沿用五天 培养的监测方式。此法操作复杂、干扰性大、重现性差、耗时耗力。 微生物传感器测BOD，以其具有快速、准确，易于实现连续在线自 动监测的优点而成为各国近二十年来研究的热点。BOD微生物传感 器主要由固定化微生物膜、换能器和信号输出装置组成。其测定原理 为微生物在氧饱和的磷酸盐缓冲溶液中，细胞处于内源呼吸阶段，微 生物的呼吸强度恒定。因此，当氧达到扩散平衡时，BOD微生物传 感器的氧电极将输出一稳定电流值I1。投加可生物降解的有机物后， 由于微生物同化有机物而呼吸强度增强，耗氧增多，由氧电极输出的 电流值逐渐降低，几分钟内达到新的动态平衡，输出另一稳定电流值 I2。在一定条件下，I1与I2的差值同有机物的浓度呈线性关系，籍此 可求出BOD值。
微生物的种类和特性是微生物传感器响应性能的决定因素。在已 研制的BOD传感器中，使用了很多类型的微生物群体。这些微生物 包括单一菌种，如：日本最近开发的BOD-3000型微生物传感器使 用的是皮状丝孢酵母菌，测定浓度范围在0-1000mg/l，使用寿命为 一个月。日本的Gab-Joo chee使用恶臭假单胞菌制作微生物膜，测 定下限达到0.5mg/l，耐盐性差，不能适用海水BOD的测量。其它被 使用过的单一菌还有异常汉氏逊酵母(Hansenula anomala)、荧光假 单孢菌(Pseudomonas fluorescens)、枯草芽苞杆菌(Bacillus subtilis)、 丁酸梭菌(Clostridium)、大肠杆菌(E.coli)、酿酒酵母 (Saccharolmyces cerevisise)等;还包括两种微生物混合体，(如： 枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合菌种(Bacillus subtilis和Bacillus licheniformis7B)、皮状丝孢酵母和地衣芽孢杆菌的混合菌种 (Trichoporon cutaneum，和B.licheniformis)等);此外还有多种菌 种构成的复合菌，如微生物菌团、活性污泥和干燥后的死细胞。
通常由复合菌构成识别元件的生物传感器有机物的广普性高，但 由于微生物性状的不一致，导致测量的不稳定性。而使用单一菌种， 测量稳定性好，一般底物广普性差，适用测量的工业废水种类少。
经检索，到目前为止尚未发现用于海水生化需氧传感器测量菌 株。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种具有高耗氧(呼吸)强度， 对有机物有广普降解行为，性状稳定，有好的固定化行为，适应固定 化物理和化学环境的用于工业废水或海水生化需氧量传感器测量菌 株—地衣芽孢杆菌的培养方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案：
本发明从淀粉厂生产废水中筛选分离得到一株高呼吸强度的好 氧菌株，并通过驯化该菌株可作为工业废水或海水BOD生物传感器 中的工作菌株。该驯化菌株的特点是对碳水化合物和有机物有广普降 解作用，耐盐，能满足工业废水或海水BOD传感器对菌株的需要。 将其固定后置于BOD传感器探头即氧电极上，响应信号大、灵敏度 高、线性关系好。该菌种经鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。
本发明的具体技术方案如下：
一.一种用于工业绩废水生化需氧量传感器测量菌株—地衣芽孢 杆菌的培养方法，其特征在于：
(1)从淀粉厂生产废水中筛选分离地衣芽孢杆菌：
a、配制固体培养基：
以淀粉厂生产废水作为培养基的配制水源配制固体培养 基;
b、用淀粉厂生产废水作为菌源均匀涂于固体平板上，于28 -32℃的培养箱中培养;在平板上长出菌落后，挑出菌落大、生长迅 速的一株菌，于上述a项固体培养基成分的不加琼脂的液体培养基中 进行扩大培养，摇床转速为130-160转/分钟，培养温度为28-32 ℃，待有菌长出后，连续转接2-3代，每代12-24小时，获得地衣 芽孢杆菌菌株;
(2)对上述地衣芽孢杆菌菌株进行逐步驯化：
a、利用所要测定的工业废水代替第(1)步中a项的淀粉厂 生产废水作为培养基的配制水源配制液体培养基，首先，使用含10% 的上述所要测定的工业废水的蒸馏水作为配制水源配制液体培养基， 于121℃高压灭菌25分种;
b、将上述地衣芽孢杆菌菌株放入培养箱中培养，温度为28 -32℃，摇床转速为130-160转/分钟，待有菌长出后，转接到含20% 的上述所要测定的工业废水配制的液体培养基中继续培养1-3代， 直至有菌明显长出;培养条件为温度28-32℃，摇床转速为130-160 转/分钟;
c、再按上述第(2)步第b项的方法依次在含40%、60%、 80%、100%的上述所要测定的工业废水配制的液体培养基中进行培养 1-3代;
d、最后再按上述第c项的方法在用100%的上述所要测定的 工业废水配制的液体培养基中进行培养3-4代，从而完成该菌的驯 化过程。
所述的固体培养基按以下组分配制：
牛肉膏0.5克、蛋白胨0.5克、可溶性淀粉0.5克、氯化镁0.1克、 琼脂1.5克、淀粉厂生产废水100毫升;调节PH值为6.8-7.2，121 ℃高压灭菌25分钟。
二、一种用于海水生化需氧量传感器测量菌株—地衣芽孢杆菌的 培养方法，其特征在于：
(1)从淀粉厂生产废水中筛选分离地衣芽孢杆菌：
a、配制固体培养基：
以淀粉厂生产废水作为培养基的配制水源配制固体培养 基;
b、用淀粉厂生产废水作为菌源均匀涂于固体平板上，于28 -32℃的培养箱中培养;在平板上长出菌落后，挑出菌落大、生长迅 速的一株菌，于上述a项固体培养基成分的不加琼脂的液体培养培基 中进行扩大培养，摇床转速为130-160转/分钟，培养温度为28-32 ℃，待有菌长出后，连续转接2-3代，每代12-24小时，获得地衣 芽孢杆菌菌株;
(2)对上述地衣芽孢杆菌菌株进行逐步驯化：
a、液体驯化培养基：
以蒸馏水作为培养基的配制水源配制液体驯化培养基;
b、将上述地衣芽孢杆菌菌株接入添加1%Nacl的液体驯化 培养基中培养并转接2-3代，每代12-24小时，培养条件为温度 28-32℃，摇床转速为130-160转/分钟;
c、按照上述b项方法依次在添加2%、3%、4%、5%NaCL的上述液体驯化培养基中培养驯化;
d、最后按上述第c项的方法在用纯海水配制的液体驯化培 养基中再进行培养并转接3-5代，从而完成该菌的海水驯化过程。
所述的固体培养基按以下组分配制：
牛肉膏0.5克、蛋白胨0.5克、可溶性淀粉0.5克、氯化镁0.1克、 琼脂1.5克、淀粉厂生产废水100毫升;调节PH值为6.8-7.2，121 ℃高压灭菌25分钟。
所述的液体驯化培养基按以下组分配制：
牛肉膏0.5%、蛋白胨0.5%、可溶性淀粉0.5%、氯化镁0.1%、 蒸馏水;调节PH值为6.8-7.2，121℃高压灭菌25分钟。
优良的BOD传感器菌种应该具有线性好、响应范围宽、响应时 间短、稳定、寿命长等优点。现就利用本发明所培养驯化的菌株用于 测定工业废水，举例说明。
(1)线性关系及响应范围图例
测定系列标准GGA溶液，传感器响应电流降低值(ΔI)与 GGA浓度(C)的关系见图1。线性相关系数达到0.99以上。响应线 性范围为0-60mg/l。
(2)膜的稳定性测试
图2列举了该菌制备的微生物膜在半月内间断测定 19.6mg/l GGA磷酸盐缓冲溶液响应电流降低值(ΔI)。11次测定相 对标准偏差4.0%。
(3)工业废水样品的测定
使用该菌作为生物识别元件的BOD测定仪与五天标准法(BOD5 法)对照测定某某化工厂污水和焦化厂工业废水，结果表明对不同有 毒、难降解的工业废水，仪器法测定值分别乘以不同的系数，与BOD5 法测定值有较好的相关性。两种方法测定结定果分别列于附表1和附 表2。
利用本发明所培养驯化的菌株用于测定海水生化需氧量的测试 结果：
以海水为底液，在去除海水中的有机物质后，分别添加不同量的 GGA溶液，得到一条标准曲线(见图3)。线性范围为0-24mg/l， 线性相关系数在0.99以上。用该标准曲线测得海水样品BOD值为 2mg/l。
本发明的有益效果如下：利用本发明培养驯化的菌株经过固定化 后用于测定生活污水、食品厂工业废水、污水处理厂出水、焦化厂工 业废水、炼油厂工业废水及海水，其测定精密度高，测定值与BOD5 有很好的相关性。
本发明通过独特的培养驯化方法，提高了菌株性能，使得菌株的 广普性好、耐盐、耐温、灵敏度高。用其制作的固定化微生物膜可用 于各种工业废水或海水BOD生物传感器，测量响应信号大、灵敏度 高、线性关系好，且该驯化菌具备无毒无害、生命力强、易大规模培 养、菌膜使用寿命长的特点。
