申请日2011.12.28
公开(公告)日2012.04.04
IPC分类号C12N1/02; C02F103/32; C02F3/02; C02F3/34
摘要
本发明公开了一种净化处理豆腐废水微生物的分离方法，本方法采用豆渣、豆腐废水和大豆面等配制选择性培养基，分离能高效净化处理豆腐废水的微生物的方法，该方法具有工艺简单、操作方便、高效、选择性好、成本低的优点，为采用生物法快速处理豆腐废水奠定基础。
权利要求书
1.一种净化处理豆腐废水微生物的分离方法，其特征在于按照如下步骤进行：
(1)选择性培养基的制备
在400-600 g豆渣中添加700-900 ml豆腐废水，搅拌，然后用纱布过滤，收集滤液并加入2-4 g 大豆面，定容到1000ml，调节PH值至中性，在121℃条件下灭菌20 min，作为液体培养基备用，制备固体培养基时，在液体培养基中添加17-18 g/L琼脂，溶解灭菌后制作平板培养基，备用;
(2)初筛
将堆肥肥料或土壤用10倍稀释法制备稀释液，稀释至105-107稀释度，将105-107稀释液分别涂布于平板培养基上，在20-35℃温度下培养24-48 h，挑选在平板培养基上菌落相对较大的菌株进行分离纯化;
(3)复筛
将步骤(2)中分离纯化的菌株分别接种于液体培养基中，在温度20-35℃和100 -160 rpm摇床下发酵1-3天，筛选出快速生长繁殖的菌株，即发酵后每毫升发酵液中微生物数量大于105个的菌株，即得净化处理豆腐废水的微生物。
2.根据权利要求1所述净化处理豆腐废水微生物的分离方法，其特征在于：土壤来源于富含有机物、潮湿的土壤或豆腐废水排放口周围的土壤。
说明书
一种净化处理豆腐废水微生物的分离方法
技术领域
本发明涉及一种净化处理豆腐废水微生物的分离方法，属于应用微生物领域。
背景技术
豆腐在中国具有悠久的历史，早在二千年前的西汉，豆腐加工工艺已经成熟。一般豆腐生产的主要原料是大豆。晒干后的大豆经筛选去除杂质后，用水浸泡、淘洗去除灰份，漂洗至洁净，使其充分吸水膨胀，然后用打浆机磨碎，用水调成豆浆。豆浆蒸煮后，根据不同的产品，加人不同量的卤水，搅拌均匀，压滤脱水后，可制成各种豆腐制品。在豆腐生产的过程中，产生大量的废水，豆腐废水主要来源于水洗、浸泡和压滤过程，另有部分冲洗水。这些废水属于高浓度有机废水，在环境中发酵，发出刺鼻的恶臭。另外，长期以来我国的豆腐加工方式一直以作坊式的加工为主，其生产能力低下，设备简陋、工艺原始、厂址分散。一般在城镇四周，生产废水进人地面水环境，引起附近水体的严重恶化。对于制豆腐废水的处理一般采用以下几种方法。
1) 采用物理化学为主的方法，例如：加药絮凝，然后进行沉淀，或者进行气浮，或者进行过滤。这些方法对浓度很高、生化性很好、溶解性污染物比例很高的有机废水，处理效率低，运行费用高，污泥产生量大。
2)采用厌氧发酵进行处理。虽然处理效果很好，但是厌氧发酵的水力停留时间长，需要4天(施玉书，徐健，马建萍 厌氧-好氧和生物净化工艺处理豆制品废水技术研究。中国沼气，17(1): 34-36)。
3) 采用好氧发酵进行处理，此法的特点是水力停留时间短，处理周期短。但需要快速利用豆腐废水微生物，高效利用豆腐废水微生物能提高豆腐废水的处理效果，加快处理进程缩短水力停留时间。
因此，对好氧发酵处理豆腐废水而言，寻求快速分离获得豆腐废水净化处理微生物的快速分离方法具有重要意义。
但目前对豆腐废水的处理基本采用厌氧发酵(秦亚平等.豆腐生产废不泊治理(I). 污染防治技术,1999, 12(2): 93-94; 张春杨等.豆腐废水UASB 反应器中的原核生物多样性及主要功能菌群. 微生物学报, 2004,44(2): 141-147)。豆腐废水的好氧处理必须具有高效降解豆腐废水的微生物。因此，获得高效降解豆腐废水微生物成为豆腐废水快速好氧处理的前提。
发明内容
本发明涉及一种净化处理豆腐废水微生物的分离方法，为豆腐废水的好氧发酵处理提供菌种保障。
本发明方法通过如下步骤进行：
1)选择性培养基的制备
在400-600 g豆渣总添加700-900 ml豆腐废水，搅拌，然后采用纱布过滤，收集滤液并加入2-4 g 大豆面，并定溶至1000ml，采用盐酸和氢氧化钠调节pH值至中性，用于固体和液体培养基的制作;制备液体培养基时，直接在121℃条件下灭菌20 min，备用;制备固体培养基时，在液体培养基中添加17-18 g/L琼脂，溶解后在121℃条件下灭菌20 min，将灭菌后的培养基分装制作平板培养基，备用;
(2)初筛
将堆肥肥料或土壤用10倍稀释法制备稀释液，稀释至105-107稀释度，将105-107稀释液分别涂布于平板培养基上，在20-35℃温度下培养24-48 h，随着培养时间的延长，会有不同的菌产生，在所有菌落中，随机挑选菌落相对较大的菌株进行分离纯化;
(3)复筛
将步骤(2)中分离纯化的菌株分别接种于液体培养基中，在20-35℃、100 -160 rpm下摇床发酵1-3天，以每毫升发酵液中微生物数量大于105个为选择条件，筛选出快速生长繁殖的菌株，即单位体积发酵液中微生物数量最多的菌株，即得净化处理豆腐废水的微生物。
本发明中所述土壤来源于富含有机物、潮湿的土壤或豆腐废水排放口周围的土壤。
本发明中所述豆腐废水为在制作豆腐制品过程中产生的废水，包括水洗、浸泡、压滤和冲洗过程中产生的废水。
本发明方法用于分离能快速处理豆腐废水的微生物，为采用生物法处理豆腐废水奠定基础，本发明方法具有工艺简单、操作方便、高效、选择性好、成本低的优点。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。
实施例1：本净化处理豆腐废水微生物的分离方法，具体操作如下：
(1)选择性培养基的制备
称取400 g豆渣添加700 ml豆腐废水，搅拌5min，然后用2层纱布过滤，收集滤液并加入2g大豆面，定容到1000ml，采用盐酸和氢氧化钠调节PH值至中性，在121℃条件下灭菌20 min，作为液体培养基，备用，制备固体培养基时，在液体培养基中添加18g/L琼脂，溶解121℃条件下灭菌20 min后制作平板培养基，备用;
(2)初筛
将堆肥肥料用10倍稀释法制备稀释液，稀释至稀释度为105，分别取0.5 ml稀释液涂布于6个平板培养基上，在30℃温度下培养40 h，6个平板上一共出现46个菌落，在所有菌落中，挑选8个直径在2 mm以上的菌落进行分离纯化;
(3)复筛
将步骤(2)中分离纯化的菌株分别接种于液体培养基中在30℃、120 rpm下摇床发酵2天，8株菌在液体培养基中的浓度都达到大于105/ml，其中3株的浓度达到107/ml，最后选择浓度最高的3株菌作为目的菌株，作为净化处理豆腐废水微生物用于好氧发酵处理豆腐废水。
实施例2：本净化处理豆腐废水微生物的分离方法，具体操作如下：
(1)选择性培养基的制备
称取500 g豆渣添加800 ml豆腐废水，搅拌5min，然后用2层纱布过滤，收集滤液并加入3g大豆面，定容到1000ml，采用盐酸和氢氧化钠调节PH值至中性，在121℃条件下灭菌20 min，作为液体培养基备用，制备固体培养基时，在液体培养基中添加17g/L琼脂，溶解121℃条件下灭菌20 min后制作平板培养基，备用;
(2)初筛
将来源于距地表约6 cm富含有机物、潮湿土壤中的土壤用10倍稀释法制备稀释液，稀释至稀释度为107，分别取0.5 ml稀释液涂布于6个平板培养基上，在20℃温度下培养48 h，6个平板上一共出现22个菌落，在所有菌落中，挑选6个直径在1.5 mm以上的菌落进行分离纯化。
(3)复筛
将步骤(2)中分离纯化的菌株分别接种于液体培养基中在20℃、100 rpm下摇床发酵3天，6株菌在液体培养基中的浓度都达到大于105/ml，其中1株的浓度达到107/ml，最后选择此株菌作为目的菌株，作为净化处理豆腐废水微生物用于好氧发酵处理豆腐废水。
实施例3：本净化处理豆腐废水微生物的分离方法，具体操作如下：
(1)选择性培养基的制备
称取600g豆渣添加900 ml豆腐废水，搅拌5min，然后用2层纱布过滤，收集滤液并加入4g大豆面，定容到1000 ml，采用盐酸和氢氧化钠调节PH值至中性，在121℃条件下灭菌20 min，作为液体培养基，备用;制备固体培养基时，在液体培养基中添加17.5g/L琼脂，溶解121℃条件下灭菌20 min后制作平板培养基，备用;
(2)初筛
将来源于豆腐废水排放口周围的潮湿土壤中的土壤用10倍稀释法制备稀释液，稀释至107稀释度，分别取0.5 ml稀释液涂布于6个平板培养基上，在35℃温度下培养24 h，6个平板上一共出现71个菌落，在所有菌落中，挑选12个直径在2-3mm以上的菌落进行分离纯化。
(3)复筛
将步骤(2)中分离纯化的菌株分别接种于液体培养基中在35℃、160 rpm下发酵1天，12株菌在液体培养基中的浓度都大于105/ml，其中2株的浓度达到108/ml，最后选择浓度最高的2株菌作为目的菌株，作为净化处理豆腐废水微生物用于好氧发酵处理豆腐废水。
