申请日2014.09.24
公开(公告)日2015.01.28
IPC分类号C12N1/20; C02F3/34; C12P1/04
摘要
本发明公开了一株芽孢杆菌及复合废水培养产絮凝剂的方法，该芽孢杆菌(Bacillus sp.)保藏编号为CGMCC NO.9143。本发明的芽孢杆菌，可以以豆制品废水和/或味精废水为培养基，发酵培养得到多糖絮凝剂。本发明的芽孢杆菌和产絮凝剂的方法，不仅可高产絮凝剂，同时能去除豆制品废水和味精废水的COD和NH4+-N，此外，得到的多糖絮凝剂不仅可以改善浓缩污泥脱水性能，而且可以去除米氏凯伦藻培养液中的米氏凯伦藻及塔马亚历山大藻培养液中的塔马亚历山大藻。
权利要求书
1.一株芽孢杆菌(Bacillus sp.)，其保藏编号为CGMCC NO.9143。
2.如权利要求1所述的芽孢杆菌Bacillus sp.的用途，其特征在于，用于制 备絮凝剂。
3.一种絮凝剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(a)将保藏编号为CGMCC NO.9143的芽孢杆菌接种于LB培养基中，培养 18-24h得到一级种子液;
任选地(b)将步骤(a)得到的一级种子液在种子培养基中培养18-24h得到二 级种子液;
以及(c)将步骤(a)得到的一级种子液或步骤(b)得到的二级种子液接种于发 酵培养基中培养得到所述絮凝剂。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中于35-45℃、 150-180rpm的条件下培养;和/或
所述步骤(b)中于35-45℃、通气量5-10L/min、搅拌速度350-450rpm的条件 下培养;和/或
所述步骤(c)中于35-45℃的条件下培养。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述种子培养基为废水培养 基，pH为7-9，包含以下组分：
豆制品废水和/或味精废水 500-800ml·L-1;
水 200-500ml·L-1，
其中，所述废水培养基包含豆制品废水和味精废水时，所述豆制品废水的含量 为250-500ml·L-1;所述味精废水的含量为150-400ml·L-1。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基为产絮凝剂 培养基或废水培养基，
所述废水培养基的pH为7-9，包含以下组分：
豆制品废水和/或味精废水 500-800ml·L-1;
水 200-500ml·L-1，
其中，所述废水培养基包含豆制品废水和味精废水时，所述豆制品废水的含量 为250-500ml·L-1;所述味精废水的含量为150-400ml·L-1。
7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(c)中，在培养至对 数期末期，流加5-15g·L-1的葡萄糖;和/或
所述步骤(c)中，在培养至对数期末期，氧饱和度维持在15-95%。
8.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括采用乙 醇沉淀出所述絮凝剂的步骤。
9.一种絮凝剂，其特征在于，采用权利要求3-9任一项所述的方法制备获得。
10.如权利要求9所述的絮凝剂的用途，其特征在于，所述絮凝剂用于：
(i)制备改善浓缩污泥脱水性能的促进剂;或
(ii)去除米氏凯伦藻;或
(iii)去除塔马亚历山大藻。
说明书
一株芽孢杆菌及复合废水培养产絮凝剂的方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株产絮凝剂的芽孢杆菌的选育、以 及味精废水和豆制品废水复合培养芽孢杆菌产絮凝剂的方法。
背景技术
生物絮凝剂具有高效、无毒和可生物降解性，是典型的环境友好功能材料，代 表了絮凝剂的重要研发方向之一。Burterfield于1935年从活性污泥中最早筛选 到产絮凝剂的微生物。20世纪70年代以来，国内外学者筛选到许多产絮凝剂的微 生物，发现从土壤、活性污泥、生活污水、工业废水以及各类沉积物样品中，均可 分离得到具有产絮能力的微生物，包括细菌、藻类、放线菌、真菌和酵母等(朱艳 彬等，中国环境科学学会学术年会论文集，2009，173-178)。20世纪末，日本学 者从旱田土壤分离筛选得到的一株红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)S-1产生 的NOC-1，是已发现效果最好的生物絮凝剂之一，具有强而广泛的絮凝活性(J Takeda M,Agric.Biol.Chem,1991,55(10):2263-2264)。
生物絮凝剂属于天然有机高分子絮凝剂，可以根据不同的方式进行分类：(1) 根据来源不同分为3类：直接利用微生物细胞的絮凝剂，如某些细菌、霉菌、放线 菌和酵母;利用微生物细胞提取物的絮凝剂，如酵母细胞壁的葡聚糖、甘露聚糖、 蛋白质和N-乙酰葡萄糖胺等;利用微生物细胞代谢产物的絮凝剂，微生物细胞分 泌到细胞外的代谢产物，主要成分为多糖及少量的多肽、蛋白质、脂类及其复合物; (2)根据化学组成的不同分为3类：糖类物质，绝大多数是代谢产生的各种多聚糖 类;多肽、蛋白质和DNA类物质，已知絮凝能力最好的生物絮凝剂NOC-1的主要成 分即为蛋白质，其最大相对分子质量为75万;脂类物质，目前发现的唯一的脂类 絮凝剂是1994年Kurane从Rhodococcus erythropolis s-1的培养液中分离出来 的生物絮凝剂;(3)根据在分散介质水中所带电荷的不同分为3类：两性型蛋白质 和多肽类大分子，为两性电解质;非离子型多糖类生物絮凝剂，属于非离子型絮凝 剂;阴离子型直接利用微生物细胞的絮凝剂(李大鹏,哈尔滨工业大学博士论文， 2010,4-5)。
以廉价底物为原料培养微生物产絮凝剂被广泛地研究。如Xiaoling Zhang等 以糖蜜为原料培养Bacillus licheniformis产絮凝剂，优化的培养基配方为 20g·L-1糖蜜、0.4g·L-1尿素、0.4g·L-1NaCl、0.2g·L-1KH2PO4、1.6g·L-1K2HPO4、 0.2g·L-1MgSO4;在优化条件下12h内产絮凝剂活性达到700U·ml-1(Xiaoling Zhang, et al,Biotechnology and Bioprocess Engineering,2012,17:1041-1047)。
影响生物絮凝剂发酵的因素很多，培养基的组成、C/N比、培养基的pH值、 温度、溶氧等都将影响生物絮凝剂的产率。细胞生长与生物絮凝剂产生的关系因菌 种不同而异。根据国内外相关研究者对胞外分泌产絮凝剂的产絮菌的研究表明，其 产生胞外代谢物的时间主要应该在对数期后期和稳定期前期、中期，在对数期前期 基本上不产絮凝剂。
目前，生物絮凝剂的研究还存在一些问题，主要表现为：(1)絮凝效率低，制 备成本高;(2)代谢途径特别是多种菌株产复合絮凝剂的代谢途经及调控机理还不 清楚;(3)从大规模工业生产和应用急需解决的关键问题(如降低成本、提高产絮 能力、生产的调控、提高产絮稳定性等)角度开展的大规模的发酵技术研究几乎是 空白。因此，继续选育具有高效、稳定的产絮能力的微生物种质资源，以及在对其 代谢途径和调控机理研究基础上开展的发酵技术研究，是生物絮凝剂真正实现大规 模工业生产的关键。
发明内容
本发明的目的在于提供一株产生物絮凝剂的细菌。
本发明的第一方面，提供一株芽孢杆菌(Bacillus sp.)，其保藏编号为CGMCC NO.9143。
本发明的第二方面，提供第一方面所述的芽孢杆菌Bacillus sp.的用途，用 于制备絮凝剂。
在另一优选例中，所述絮凝剂为多糖。
本发明的第三方面，提供一种絮凝剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将保藏编号为CGMCC NO.9143的芽孢杆菌接种于LB培养基中，培养 18-24h得到一级种子液;
任选地(b)将步骤(a)得到的一级种子液在种子培养基中培养18-24h得到二 级种子液;
以及(c)将步骤(a)得到的一级种子液或步骤(b)得到的二级种子液接种于发 酵培养基中培养得到所述絮凝剂。
在另一优选例中，所述絮凝剂为多糖。
在另一优选例中，所述步骤(a)中于35-45℃、150-180rpm的条件下培养。
在另一优选例中，所述步骤(b)中于35-45℃、通气量5-10L/min、搅拌速度 350-450rpm的条件下培养。
在另一优选例中，所述步骤(c)中于30-50℃(较佳地35-45℃)的条件下培养。
在另一优选例中，所述种子液的菌液浓度为1-2×109cfu·ml-1。
在另一优选例中，所述步骤(b)中，所述一级种子液与所述种子培养基的体积 比3-10:100，较佳地为4-6:100，更佳为5:100。
在另一优选例中，所述二级种子液或所述一级种子液与所述发酵培养基的体积 比为5-15:100，较佳地为8-12:100，更佳为10:100。
在另一优选例中，所述发酵培养基为产絮凝剂培养基，较佳地，所述产絮凝剂 培养基的组成为：葡萄糖20g、K2HPO45g、KH2PO42g、(NH4)2SO40.2g、NaCl 0.1g、 尿素0.5g、酵母膏0.5g、MgSO40.2g、H2O 1000ml、pH7.5。
在另一优选例中，所述种子培养基为废水培养基，pH为7-9，包含以下组分：
豆制品废水和/或味精废水 500-800ml·L-1;
水 200-500ml·L-1，
其中，所述废水培养基包含豆制品废水和味精废水时，所述豆制品废水的含量 为250-500ml·L-1，较佳地为300-400ml·L-1;所述味精废水的含量为150-400 ml·L-1，较佳地200-300ml·L-1。
在另一优选例中，所述发酵培养基为废水培养基，pH为7-9，包含以下组分：
豆制品废水和/或味精废水 500-800ml·L-1;
水 200-500ml·L-1，
其中，所述废水培养基包含豆制品废水和味精废水时，所述豆制品废水的含量 为250-500ml·L-1，较佳地为300-400ml·L-1;所述味精废水的含量为150-400 ml·L-1，较佳地200-300ml·L-1。
在另一优选例中，所述发酵培养基中还含有0.5-5g·L-1KH2PO4;较佳地为1-4 g·L-1KH2PO4;更佳地为1.2-3.5g·L-1KH2PO4。
在另一优选例中，所述发酵培养基中还含有葡萄糖，所述葡糖糖的含量为5-15 g·L-1。
在另一优选例中，所述步骤(c)中，在培养至对数期末期，流加5-15g·L-1的 葡萄糖，较佳地流加8-12g·L-1的葡萄糖。
在另一优选例中，所述步骤(c)中，在培养至对数期末期，氧饱和度维持在 15-95%，较佳地为20-90%，更佳地为25-65%。
在另一优选例中，所述制备方法还包括采用乙醇沉淀出所述絮凝剂的步骤。
在另一优选例中，所述乙醇与所述步骤(c)获得的发酵液的体积比为3-4:1。
本发明的第四方面，提供一种絮凝剂，采用第三方面所述的方法制备获得。
在另一优选例中，所述絮凝剂为多糖。
在另一优选例中，所述絮凝剂具有以下一个或多个特征：
(1)具有如图3所示的红外特征谱图;
(2)具有如图4所示的紫外特征谱图。
本发明的第五方面，提供第四方面所述的絮凝剂的用途，所述絮凝剂用于：
(i)制备改善浓缩污泥脱水性能的促进剂;或
(ii)去除米氏凯伦藻;或
(iii)去除塔马亚历山大藻。
在另一优选例中，去除米氏凯伦藻培养液中的米氏凯伦藻。
在另一优选例中，去除塔马亚历山大藻培养液中的塔马亚历山大藻。
在另一优选例中，所述米氏凯伦藻培养液是F/2培养基。
在另一优选例中，所述塔马亚历山大藻培养液是F/2培养基。
在另一优选例中，所述F/2培养基配方：NaNO375mg、NaH2PO4·H2O 5mg、 Na2SiO3·9H2O 20mg、Na2EDTA 4.36mg、FeCl3·6H2O 3.16mg、CuSO4·5H2O 0.01mg、 ZnSO4·7H2O 0.023mg、CoCl2·6H2O 0.012mg、MnCl2·4H2O 0.18mg、Na2MoO4·2H2O 0.07mg、 维生素B10.1g、维生素B120.5g、生物素0.5g、自然海水(0.4μm孔径滤膜过滤) 1000ml。
本发明的芽孢杆菌和产絮凝剂的方法，不仅可高产絮凝剂，而且在较高温度下 培养，同时能去除豆制品废水和味精废水的COD和NH4+-N，此外，得到的多糖絮凝 剂不仅可以改善浓缩污泥脱水性能，而且可以去除米氏凯伦藻培养液中的米氏凯伦 藻及塔马亚历山大藻培养液中的塔马亚历山大藻。
应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于 篇幅，在此不再一一赘述。
