申请日2018.12.03
公开(公告)日2019.03.19
IPC分类号C12N1/20; C12N15/74; C02F3/34; C12R1/01
摘要
本发明公开了一种循环利用废水连续发酵培养微生物的方法及其所用具有自凝絮和自沉降特性的细菌，所述具有自凝絮和自沉降特性的细菌属于嗜盐性细菌，在不低于0.08M盐浓度条件下能发生自凝絮和自沉降。本发明利用洗涤自沉降的细菌菌体产生的废水继续发酵培养微生物，不仅可以减少由于离心、废水处理和灭菌产生的能耗，还可以提高产率。本发明的细菌可成为下一代工业微生物的平台菌，本发明的循环利用废水连续发酵培养方法能用于大规模生物发酵。
权利要求书
1.一种循环利用废水连续发酵培养微生物的方法，其特征在于，包括：
S1：将具有自凝絮和自沉降特性的细菌接种到初始发酵培养基中进行发酵培养;
S2：经过第一发酵培养后，从第一发酵产物中分离第一自沉降的细菌菌体，将洗涤所述第一自沉降的细菌菌体产生的废水加入分离后剩余的第一上清，继续第二发酵培养;
S3：经过第二发酵培养后，从第二发酵产物中分离第二自沉降的细菌菌体，将洗涤所述第二自沉降的细菌菌体产生的废水加入分离后剩余的第二上清，继续下一发酵培养;
S4：重复所述步骤S3连续N次，N为自然数;
S5：合并各步骤洗涤后的细菌菌体为收获的微生物。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2和/或步骤S3中所述分离为从静置分层的发酵产物的下层获取自沉降的细菌菌体;优选地，所述静置分层的时间为10-30min。
3.权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述细菌为嗜盐性细菌，优选盐单胞菌属(Halomonas sp.)。
4.权利要求3所述的方法，其特征在于，所述自凝絮和自沉降特性是指细菌在不低于0.08M盐浓度条件下能发生自凝絮和自沉降。
5.权利要求4所述的方法，其特征在于，所述具有自凝絮和自沉降特性的细菌为盐单胞菌属细菌经敲除etf-α和etf-β基因的细菌。
6.权利要求5所述的方法，其特征在于，所述具有自凝絮和自沉降特性的细菌的16SrDNA序列为SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13所示的序列。
7.权利要求6所述的方法，其特征在于，所述细菌为盐单胞菌(Halomonascampaniensis)LSKO，保藏号为CGMCC No.16437。
8.权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的体系中盐浓度不低于0.08mol/L;和/或
步骤S1中所述具有自凝絮和自沉降特性的细菌在初始发酵培养基中的OD600为2-4;和/或
步骤S2中所述第一发酵培养的时间为44-52h;和/或
步骤S3中所述第二发酵培养的时间为20-28h。
9.一种具有自凝絮和自沉降特性的细菌，其特征在于，所述细菌属于嗜盐性细菌，且在不低于0.08M盐浓度条件下能发生自凝絮和自沉降;优选地，所述细菌属于盐单胞菌属。
10.权利要求9所述的细菌，其特征在于，所述细菌为盐单胞菌属细菌经敲除etf-α和etf-β基因的细菌。
11.权利要求10所述的细菌，其特征在于，所述细菌的16S rDNA序列为SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13所示的序列。
12.权利要求9-11中任一项所述所述的细菌，其特征在于，所述细菌为盐单胞菌(Halomonas campaniensis)LSKO，保藏号为CGMCC No.16437。
13.一种具有自凝絮和自沉降特性的细菌的改造方法，其特征在于，所述方法包括将盐单胞菌属细菌的etf-α和etf-β基因敲除。
说明书
一种循环利用废水连续发酵培养微生物的方法及其所用具有自凝絮和自沉降特性的细菌
技术领域
本发明属于生物技术应用领域，具体涉及一种盐循环利用废水连续发酵培养微生物的方法及其所用具有自凝絮和自沉降特性的细菌。
背景技术
工业中的大规模生物发酵受制于目前的发酵工艺，相比于石油化工，成本始终过高。成本过高的原因一方面是产物的产率较低;一方面是由于生产工艺过程中的大量能耗，其中灭菌、搅拌以及复杂的下游处理占较大比例，并且还会产生较多废水，污染环境。
目前，本申请人已经基于盐单胞菌开发了一套无灭菌的开放式连续发酵工艺，其不需要灭菌，大大降低了生产过程中的工艺能耗。但是由于其下游工艺中的离心产生的能耗以及较低的产率，成本依然很高，并且生产过程中会产生含盐废水，污染环境，仍然限制着工业中的大规模生物发酵。
发明内容
为解决现有技术中存在的一个或多个问题，本发明的一个方面是提供一种循环利用废水连续发酵培养微生物的方法，包括：
S1：将具有自凝絮和自沉降特性的细菌接种到初始发酵培养基中进行发酵培养;
S2：经过第一发酵培养后，从第一发酵产物中分离第一自沉降的细菌菌体，将洗涤所述第一自沉降的细菌菌体产生的废水加入分离后剩余的第一上清，继续第二发酵培养;
S3：经过第二发酵培养后，从第二发酵产物中分离第二自沉降的细菌菌体，将洗涤所述第二自沉降的细菌菌体产生的废水加入分离后剩余的第二上清，继续下一发酵培养;
S4：重复所述步骤S3连续N次，N为自然数;
S5：合并各步骤洗涤后的细菌菌体为收获的微生物。
本发明提供的循环利用废水连续发酵培养微生物的方法中步骤S2和/或步骤S3中所述分离为从静置分层的发酵产物的下层获取自沉降的细菌菌体;其中所述静置分层的时间可为10-30min。
上述具有自凝絮和自沉降特性的细菌为嗜盐性细菌，优选为盐单胞菌属(Halomonas sp.)。
上述自凝絮和自沉降特性是指细菌在不低于0.08M盐浓度条件下能发生自凝絮和自沉降。该细菌的自凝絮和自沉降特性是可逆的，在盐浓度低于0.08M的条件下时，自凝絮和自沉降现象可逐渐消失。
上述具有自凝絮和自沉降特性的细菌为盐单胞菌属细菌经敲除etf-α和etf-β基因后的细菌。
上述具有自凝絮和自沉降特性的细菌的16S rDNA序列为SEQ ID NO:12或SEQ IDNO:13所示的序列。
上述具有自凝絮和自沉降特性的细菌为盐单胞菌(Halomonas campaniensis)LSKO，保藏号为CGMCC No.16437。
本发明提供的循环利用废水连续发酵培养微生物的方法中，发酵培养的体系中盐浓度不低于0.08mol/L;和/或
发酵培养在搅拌和通气条件下进行，其中所述搅拌的初始转速为200-250RPM，培养5-8小时后，转速稳定在700-800RPM;所述通气的速率为1vvm;所述发酵培养的温度为20℃-45℃;所述发酵培养的体系的初始pH值为5.0-11.0;所述发酵培养的体系的初始溶氧为5%-100%;和/或
步骤S1中所述具有自凝絮和自沉降特性的细菌在初始发酵培养基中的OD600为2-4;和/或
步骤S2中所述第一发酵培养的时间为44-52h;和/或
步骤S3中所述第二发酵培养的时间为20-28h;和/或
步骤S2中所述继续第二发酵培养时和步骤S3中所述继续下一发酵培养时，培养体系中自凝絮和自沉降细菌的OD600均为25-30;和/或
其中1升所述初始发酵培养基由氯化钠20g-200g、葡萄糖5g-100g、酵母粉0g-50g、氯化铵0.5g-20g、尿素0g-20g、硫酸镁0.1g-5g、磷酸二氢钾0.5g-10g、十二水合磷酸氢二钠1g-20g、1mL-30mL微量元素I和0.1mL-10mL微量元素II和自来水组成，用自来水定容至1升;
其中1升所述微量元素I按照如下方法制备：将柠檬酸铁铵2g-10g、二水合氯化钙1g-5g和0.5mol/L盐酸水溶液混合，用0.5mol/L盐酸水溶液补足至1升，得到所述微量元素I;
其中1升微量元素II按照如下方法制备：将七水合硫酸锌50mg-200mg、四水合氯化锰10mg-50mg、硼酸100mg-500mg、六水合氯化钴50mg-400mg、五水合硫酸铜3mg-30mg、六水合氯化镍5mg-50mg、二水合钼酸钠10mg-50mg和0.5mol/L盐酸水溶液混合，用0.5mol/L盐酸水溶液补足至1升，得到所述微量元素II。
本发明的另一方面是提供一种具有自凝絮和自沉降特性的细菌，所述细菌属于嗜盐性细菌，且在不低于0.08M盐浓度条件下能发生自凝絮和自沉降。
本发明提供的具有自凝絮和自沉降特性的细菌属于盐单胞菌属。
上述具有自凝絮和自沉降特性的细菌为盐单胞菌属细菌经敲除etf-α和etf-β基因后的细菌。
上述具有自凝絮和自沉降特性的细菌的16S rDNA序列为SEQ ID NO:12或SEQ IDNO:13所示的序列。
上述具有自凝絮和自沉降特性的细菌为盐单胞菌LSKO，保藏号为CGMCCNo.16437。
本发明的另一方面还提供一种具有自凝絮和自沉降特性的细菌的改造方法，包括将盐单胞菌属细菌的etf-α和etf-β基因敲除。
基于以上技术方案，本发明基于具有自凝絮和自沉降特性的细菌首次提出一种循环利用废水连续发酵培养微生物的方法以及用于该方法的具有自凝絮和自沉降特性的细菌。本发明具有以下有益效果：
1)由于本发明的具有自凝絮和自沉降特性的细菌在不低于0.08M盐浓度条件下能发生自凝絮和自沉降，因此在连续发酵培养过程中无需采用离心分离发酵产物，只需要静置分层即可实现自沉降的细菌菌体与上清的分离，分离的菌体用于下游处理和产物的提取，洗涤分离的细菌菌体产生的含盐废水加入到上清中，上清中由于还含有部分未分离的悬浮菌株，可用作下一轮继续发酵培养，因此可以消除生产过程中由于离心而产生的能耗以及省去后续繁琐的发酵培养体系的灭菌和接种步骤，并且整个发酵培养过程中可以循环利用废水，节约了大量的水资源和成本。
2)本发明提供的循环利用废水连续发酵培养微生物的方法，在用于生产聚-3-羟基丁酸酯(Poly-3-hydroxybutyrate，简称PHB)时，与传统生产PHB的发酵工艺相比，本发明提供的循环利用废水连续发酵工艺在细胞干重上从传统产率的0.45g/L/h提升到0.82g/L/h;生产的PHB从传统产率的0.18g/L/h提升到0.33g/L/h，均得到很大提高。
3)本发明通过基因工程技术手段从盐单胞菌LS21和盐单胞菌TD01出发，得到了本发明的具有自凝絮和自沉降特性的细菌菌株，该菌株能够在高盐高碱的环境下生长，并且在不低于0.08M盐浓度的条件下能发生自凝絮和自沉降。将具有该特性的菌株用于本发明的循环利用废水连续发酵培养微生物的方法中，扩宽的此类细菌的用途，可用于工业中大规模生物发酵的连续工艺，本发明提供的菌株有望成为下一代工业微生物的平台菌。
