申请日2016.08.09
公开(公告)日2016.10.26
IPC分类号C12Q1/68; C12Q1/04; C12N15/11
摘要
本发明涉及一种鉴定环氧丙烷皂化废水活性污泥中真核藻类多样性的引物及方法。所述引物为一对，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还涉及鉴定环氧丙烷皂化废水活性污泥中真核藻类多样性的方法。本发明通过设计真核藻类特异性引物，可以从环氧丙烷皂化废水活性污泥宏基因组DNA中特异性扩增获得不同真核藻类，从而能够鉴定活性污泥中的真核藻类种类。
权利要求书
1.一种鉴定环氧丙烷皂化废水活性污泥中真核藻类多样性的引物，其特征在于，该引物为一对，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种鉴定环氧丙烷皂化废水活性污泥中真核藻类多样性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取环氧丙烷皂化废水活性污泥样品，提取总DNA;
(2)以步骤(1)制得的总DNA为模板，利用权利要求1所述鉴定环氧丙烷皂化废水活性污泥中真核藻类多样性的引物进行PCR扩增，制得扩增产物;扩增产物的片段大小在700bp左右;
(3)对步骤(2)制得的扩增产物进行测序，测序结果进行blastn比对定种;
(4)将步骤(3)的测序结果输入GenBank，通过BLAST程序在GenBank中进行相似性搜索，并从比对后所得的结果中找到相似度比较高的序列进行比对分析，应用MAGA4.0软件使用N-J法构建系统进化树，点击Bootstrap Test of Phylogeny选择Neighbor-Joining进行bootstrap值分析，经重复取样，得到可信度最高的一棵。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，提取总DNA的步骤如下：
取环氧丙烷皂化废水活性污泥样品，4℃条件下4000r/min离心10min，弃上清，使用土壤DNA提取试剂盒提取活性污泥中的宏基因组DNA。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，PCR扩增体系如下，总体系50μL：
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min;94℃变性45s，54℃退火45s，72℃延伸45s，进行35个循环;72℃延伸7min。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，对扩增产物进行测序的步骤如下：
回收步骤(2)制得的扩增产物，连接入PGM-T载体，制得连接产物，然后转化大肠杆菌JM109感受态细胞，然后进行测序。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述连接入PGM-T载体的连接体系为10μL：
连接条件为：16℃连接过夜。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌JM109感受态细胞采用如下方法制备：
(I)受体菌的培养
取活化的大肠杆菌(E.coli)JM109单菌落，接种于3～5ml LB液体培养基中，37℃下振荡培养10～14小时至对数生长后期，将该菌悬液以1:(50～100)的体积比接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2～3小时至OD600=0.4～0.6，制得培养液;
(II)CaCl2法制备感受态细胞
①将培养液转入离心管中，冰置10分钟，然后于4℃下3000g离心10分钟;
②弃上清，用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液10ml轻轻悬浮细胞，冰置15～30分钟后，4℃下3000g离心10分钟;
③弃上清，加入4ml预冷含质量浓度为15%甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰置3分钟，制得感受态细胞悬液;
进一步优选的，上述转化大肠杆菌JM109感受态细胞的步骤如下：
①大肠杆菌JM109感受态细胞200μL加连接产物1μL混合物于离心管中，冰上放置30min，期间摇动3次防止受体菌沉底;
②42℃水浴加热90秒，拿出放入冰上2min;
③加灭菌LB液体培养基800μL，混匀;
④37℃、180rpm摇床培养45min，使菌体复苏;
⑤3000rpm离心2min，去上清800μL，余下200μL，重悬;
⑥重悬液涂于固体培养基上，室温静置30分钟直至液体被吸收;
⑦37℃恒温箱，倒置培养12～20h，制得。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述LB液体培养基，每升组分如下：
胰蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g;
所述固体培养基在LB液体培养基的基础上，每升加入如下组分：
50mg/ml氨苄青霉素(Amp)200ml、质量浓度20%的IPTG 350μL、质量浓度2%的X-gal2ml、琼脂20g。
9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，对测序结果进行blastn比对定种的步骤如下：
登录网站http：//www.ncbi.nlm.nih.gov，点击BLAST;然后进入tblatn，在EnterQuery Sequence对话框中将测序后的序列复制粘贴，点击BLAST，Gen Bank自动把输入的序列与序列资源库中所有相关序列进行比较;在比较结果中，找出同源性最高的一个确定未知藻的种属;
优选的，所述步骤(4)中，重复取样次数为1000次。
说明书
一种鉴定环氧丙烷皂化废水活性污泥中真核藻类多样性的引物及方法
技术领域
本发明涉及一种鉴定环氧丙烷皂化废水活性污泥中真核藻类多样性的引物及方法，属于生物技术领域。
背景技术
环氧丙烷皂化废水是一种由氯醇法生产环氧丙烷过程产生的大量污水。该废水具有pH值高、氯化钙含量高、COD高的特点，其中含有大量难以生化降解的氯化物，如氯丙醇、二氯异丙醚、二氯丙烷等。这种高盐、富含有机物的废水可对环境造成严重污染，采用合理有效的方式处理这种废水不容忽视。
生物活性污泥法是当前环氧丙烷皂化废水处理的主要方式。活性污泥是污水处理厂曝气池内有机污染物质转化的主体，其生物活性的高低从根本上决定了一个污水处理厂的污水处理能力，而活性污泥的生物活性又主要取决于其中的微生物菌群结构和功能，包括细菌、古菌、病毒以及真核藻类等微生物。
中国专利文献CN103849678A(申请号201210517032.X)公开了一种快速微藻种属鉴定的方法。主要步骤为：将单藻落挑取至事先加入10～20μL水的PCR管中，或者含藻水体离心收集藻细胞104～106个后加入10～20μL水的PCR管中，将藻细胞吹打散开后，直接将PCR管置于PCR仪中，于99℃加热20～30min，再次吹打使DNA释放作为模板，以真核细胞通用18SrDNA或ITS引物进行PCR反应。通过对产物测序和序列分析，可获得待测藻株的种属信息。
虽然上述鉴定方法能够鉴定待测藻株的种属信息，但由于活性污泥中微生物群落结构复杂，上述方法无法进行准确鉴定，而且绝大多数的微生物是不能被传统方法分离培养的，通过传统的富集、分离、培养很难对污泥微生物群落进行准确分析。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种鉴定环氧丙烷皂化废水活性污泥中真核藻类多样性的引物及方法。
本发明的技术方案如下：
一种鉴定环氧丙烷皂化废水活性污泥中真核藻类多样性的引物，该引物为一对，上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
上游引物：5’-AAAGTTAGGTGAGCG-3’;SEQ ID NO.1
下游引物：5’-CAGTCAATCGGTATG-3’。SEQ ID NO.2
一种鉴定环氧丙烷皂化废水活性污泥中真核藻类多样性的方法，包括如下步骤：
(1)取环氧丙烷皂化废水活性污泥样品，提取总DNA;
(2)以步骤(1)制得的总DNA为模板，利用上述鉴定环氧丙烷皂化废水活性污泥中真核藻类多样性的引物进行PCR扩增，制得扩增产物;扩增产物的片段大小在700bp左右;
(3)对步骤(2)制得的扩增产物进行测序，测序结果进行blastn比对定种;
(4)将步骤(3)的测序结果输入GenBank，通过BLAST程序在GenBank中进行相似性搜索，并从比对后所得的结果中找到相似度比较高的序列进行比对分析，应用MAGA4.0软件使用N-J法构建系统进化树，点击Bootstrap Test of Phylogeny选择Neighbor-Joining进行bootstrap值分析，经重复取样，得到可信度最高的一棵。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，提取总DNA的步骤如下：
取环氧丙烷皂化废水活性污泥样品，4℃条件下4000r/min离心10min，弃上清，使用土壤DNA提取试剂盒提取活性污泥中的宏基因组DNA。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，PCR扩增体系如下，总体系50μL：
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5min;94℃变性45s，54℃退火45s，72℃延伸45s，进行35个循环;72℃延伸7min。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，对扩增产物进行测序的步骤如下：
回收步骤(2)制得的扩增产物，连接入PGM-T载体，制得连接产物，然后转化大肠杆菌JM109感受态细胞，然后进行测序。
进一步优选的，上述连接入PGM-T载体的连接体系为10μL：
连接条件为：16℃连接过夜。
进一步优选的，上述大肠杆菌JM109感受态细胞采用如下方法制备：
(I)受体菌的培养
取活化的大肠杆菌(E.coli)JM109单菌落，接种于3～5ml LB液体培养基中，37℃下振荡培养10～14小时至对数生长后期，将该菌悬液以1:(50～100)的体积比接种于100mlLB液体培养基中，37℃振荡培养2～3小时至OD600=0.4～0.6，制得培养液;
(II)CaCl2法制备感受态细胞
①将培养液转入离心管中，冰置10分钟，然后于4℃下3000g离心10分钟;
②弃上清，用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液10ml轻轻悬浮细胞，冰置15～30分钟后，4℃下3000g离心10分钟;
③弃上清，加入4ml预冷含质量浓度为15%甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰置3分钟，制得感受态细胞悬液;
进一步优选的，上述转化大肠杆菌JM109感受态细胞的步骤如下：
①大肠杆菌JM109感受态细胞200μL加连接产物1μL混合物于离心管中，冰上放置30min，期间摇动3次防止受体菌沉底;
②42℃水浴加热90秒，拿出放入冰上2min;
③加灭菌LB液体培养基800μL，混匀;
④37℃、180rpm摇床培养45min，使菌体复苏;
⑤3000rpm离心2min，去上清800μL，余下200μL，重悬;
⑥重悬液涂于固体培养基上，室温静置30分钟直至液体被吸收;
⑦37℃恒温箱，倒置培养12～20h，制得。
进一步优选的，上述LB液体培养基，每升组分如下：
胰蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g。
上述固体培养基在LB液体培养基的基础上，每升加入如下组分：
50mg/ml氨苄青霉素(Amp)200ml、质量浓度20%的IPTG 350μL、质量浓度2%的X-gal 2ml、琼脂20g。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，对测序结果进行blastn(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)比对定种的步骤如下：
登录网站http：//www.ncbi.nlm.nih.gov，点击BLAST;然后进入tblatn，在EnterQuery Sequence对话框中将测序后的序列复制粘贴，点击BLAST，Gen Bank自动把输入的序列与序列资源库中所有相关序列进行比较;在比较结果中，找出同源性最高的一个确定未知藻的种属。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中，重复取样次数为1000次。
有益效果
1、本发明通过设计真核藻类特异性引物，可以从环氧丙烷皂化废水活性污泥宏基因组DNA中特异性扩增获得不同真核藻类，从而能够鉴定活性污泥中的真核藻类种类;
2、本发明所述的鉴定环氧丙烷皂化废水活性污泥中真核藻类多样性的方法，步骤简单，能够有效分离鉴定出活性污泥中的真核藻类，为进一步研究真核藻类在活性污泥中的作用及整个污泥菌群的作用奠定了基础。
