申请日2011.12.21
公开(公告)日2012.05.02
IPC分类号C12N1/20; C12P19/04; C02F103/20; C12R1/07; C02F1/56
摘要
本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌，保藏名称为：解淀粉芽孢杆菌ZJ28#Bacillus amyloliquefaciens ZJ28#，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国 武汉 武汉大学;保藏日期：2011年11月24日，保藏号：CCTCC No：M2011419。本发明还同时公开了上述解淀粉芽孢杆菌的用途：用于制备奶牛养殖废水专用微生物絮凝剂。本发明还同时公开了上述奶牛养殖废水专用微生物絮凝剂的制备方法。该絮凝剂专门用来处理奶牛养殖废水，有助于解决奶牛养殖废水处理中出现的成本高、易造成二次污染等技术难题。
权利要求书
1.一种解淀粉芽孢杆菌，其特征是：保藏名称为：解淀粉芽孢杆菌ZJ28#Bacillus amyloliquefaciens ZJ28#，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国 武汉 武 汉大学;保藏日期：2011年11月24日，保藏号：CCTCC No：M2011419。
2.如根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的用途，其特征是：用于制备奶牛养殖废 水专用微生物絮凝剂。
3.如权利要求2所述的奶牛养殖废水专用微生物絮凝剂的制备方法，其特征是包括如 下步骤：
1)、制备种子液：
将解淀粉芽孢杆菌ZJ28#Bacillus amyloliquefaciens ZJ28#CCTCC No：M2011419接种 于特制液体培养基中，于28～32℃下150～250r/min振荡培养24～30小时，得种子液;
2)、将种子液以2.0～3.0∶100的体积比接种到发酵培养基中，于28～32℃、摇床转速 为180～250r/min的条件下培养36～48h，获得发酵液;
3)、将发酵液离心，所得的上清液为奶牛养殖废水专用微生物絮凝剂。
4.根据权利要求3所述的奶牛养殖废水专用微生物絮凝剂的制备方法，其特征是所述 特制液体培养基为：
在每L的基础液体培养基上添加90～110ml COD浓度为1000～10000mg/L的奶牛养殖 废水;然后调节pH至7.4～7.6。
5.根据权利要求4所述的奶牛养殖废水专用微生物絮凝剂的制备方法，其特征是： 所述发酵培养基的制备方法为：
将奶牛养殖废水稀释至COD为4000～6000mg/L，得稀释后的奶牛养殖废水;在每升 稀释后的奶牛养殖废水中加入葡萄糖0.1～5g、磷酸二氢钾1～2g、硫酸铵0.1～1g、硫酸镁 0.1～0.3g和氯化钠0.01～0.1g，然后调节pH至7～8。
说明书
奶牛养殖废水专用微生物絮凝剂的制备方法及所用菌株
技术领域
本发明涉及一种絮凝剂，特别涉及一种专门用来处理奶牛养殖废水的微生物絮凝剂 的生产方法;本发明还涉及该微生物絮凝剂的使用方法。
背景技术
随着现代经济的不断发展，畜牧业也得到了快速的发展，规模化的畜牧养殖场不断涌 现，其对发展农村经济、提高居民生活水平的同时却带来了环境的恶化——养殖废水污染。 其中，奶牛养殖废水具有固液混杂、悬浮物多、有机质含量高、碳氮比失调、不易处理等 特点，严重危害环境和人类健康。
絮凝技术是目前国内外用于提高水质处理效率的一种既经济又简便的水处理技术，其 关键问题是絮凝剂的选择。目前，在畜禽养殖废水处理领域中，无机絮凝剂和有机高分子 絮凝剂的使用比较普遍，而其中又以聚合氯化铝(PAC)和聚丙烯酰胺(PAM)最为常见。近 年来的研究表明：无机絮凝剂如PAC在饮用水中使用过多，会导致老年痴呆症的患者比 例升高;有机高分子絮凝剂如PAM使用过程中不易被降解，且残留单体有神经毒性和三 致效应(致畸、致癌、致突变)，这两种类型的絮凝剂在使用过程中都会对环境产生二次 污染。
从化学组成上讲，微生物絮凝剂主要成分为具有两性多聚电解质特性的糖蛋白、蛋白 质、多糖、纤维素和DNA等高分子化合物，它具有生物分解性、安全性、高效、无毒、 无二次污染的优点，其在国内外废水处理和研究领域显示出巨大的潜力、展现了良好的前 景。因此微生物絮凝剂可以作为新型的絮凝剂，代替传统的絮凝剂用于水处理。
目前，对微生物絮凝剂的研究主要停留在微生物絮凝剂产生菌的筛选及条件优化两个 方面。主要有微生物絮凝剂的产生率的影响因素、絮凝剂的分离纯化、组成成分、作用机 理、活性分析以及相关的应用的研究等。因为在技术工艺方面没有十分成熟，所以都没有 广泛的应用于工业上。现在很多的研究都处于实验室阶段。
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)能够产生多糖类物质，该菌之前因其能产 生一些代谢产物来抑制真菌和细菌的活性而被关注与研究。有报道，解淀粉芽孢杆菌发酵 产生的絮凝剂可应用于海水的水质处理。但目前，还未看到解淀粉芽孢杆菌在养殖废水领 域，特别是奶牛养殖废水处理中得到应用的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种微生物絮凝剂，该絮凝剂专门用来处理奶牛养殖 废水，有助于解决奶牛养殖废水处理中出现的成本高、易造成二次污染等技术难题。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌，保藏名称为：解淀粉芽孢 杆菌ZJ28#Bacillus amyloliquefaciens ZJ28#，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏 地址：中国 武汉 武汉大学;保藏日期：2011年11月24日，保藏号：CCTCC No：M2011419。
本发明还同时提供了上述解淀粉芽孢杆菌的用途：用于制备奶牛养殖废水专用微生物 絮凝剂。
本发明还同时提供了上述奶牛养殖废水专用微生物絮凝剂的制备方法，包括如下步 骤：
1)、制备种子液：
将解淀粉芽孢杆菌ZJ28#Bacillus amyloliquefaciens ZJ28#CCTCC No：M2011419接种 于特制液体培养基中，于28～32℃下150～250r/min振荡培养24～30小时，得种子液;
2)、将种子液以2.0～3.0∶100的体积比接种到发酵培养基中，于28～32℃、摇床转速 为180～250r/min的条件下培养36～48h，获得发酵液;
3)、将发酵液离心，所得的上清液为奶牛养殖废水专用微生物絮凝剂。
作为本发明的奶牛养殖废水专用微生物絮凝剂的制备方法的改进：特制液体培养基 为：在每L的基础液体培养基上添加90～110ml COD浓度为1000～10000mg/L的奶牛养殖废 水;然后调节pH至7.4～7.6。
作为本发明的奶牛养殖废水专用微生物絮凝剂的制备方法的进一步改进：发酵培养基 的制备方法为：
将奶牛养殖废水稀释至COD为4000～6000mg/L，得稀释后的奶牛养殖废水;在每升稀 释后的奶牛养殖废水中加入葡萄糖0.1～5g、磷酸二氢钾1～2g、硫酸铵0.1～1g、硫酸镁0.1～0.3g 和氯化钠0.01～0.1g，然后调节pH至7～8。
本发明具体包括如下内容：
1)、絮凝剂产生菌的分离：
取奶牛养殖废水处理池活性污泥样品，经稀释、涂板于特制的NA固体培养基上，用 30℃的电热恒温培养箱平板富集培养，挑选生长旺盛、表面光滑、有点透明的、粘稠的单 个菌落，反复划线获取单个菌落，再进行多次划线分离，直至获得较纯的单菌落。利用絮 凝效果实验对初筛的菌株进行复筛。最后获得该菌株，并鉴定为解淀粉芽孢杆菌。
上述特制的NA固体培养基由基础NA培养基和奶牛养殖废水组成，基础NA培养基 的成分组成为：蛋白胨9～11g，牛肉膏2.5～3.5g，NaCl 4.5～5.5g，琼脂15～20g和H2O 1000 ml，在上述每升的基础NA培养基上添加90～110ml COD浓度为1000～10000mg/L的奶牛 养殖废水，并调节pH=7.4～7.6(例如可用1mol/L的NaOH进行调节)，得特制的NA培 养基。
2)、微生物絮凝剂的获得：
用特制液体培养基培养分离到解淀粉芽孢杆菌种子液，菌株种子液以(2.0～3.0)∶100 的体积比接种到发酵培养基中，初始pH值为7～8(为自然值，非人为调节)，温度为28～32 ℃，摇床转速为150～250r/min，培养36～48h，获得发酵液，取其上清液即为微生物絮凝 剂产品。
上述所用的特制液体培养基是由上述特制的NA固体培养基改变获得，即不加琼脂， 其余成分和用量相同。即，基础液体培养基的成分组成为：蛋白胨9～11g，牛肉膏2.5～3.5g， NaCl 4.5～5.5g和H2O 1000ml，在上述每升的基础液体培养基上添加90～110ml COD浓度 为1000～10000mg/L的奶牛养殖废水，并调节pH=7.4～7.6(例如可用1mol/L的NaOH进 行调节)，得特制液体培养基。
3)处理养殖废水：
将得到的微生物絮凝剂与奶牛养殖废水按1∶40～60的体积比相混合，充分混匀 30～45min分钟后，经200～300目筛进行过滤，去除滤渣。经处理后，废水的化学需氧量、 生物需氧量和浊度等的下降程度可达无机絮凝剂聚合氯化铝(PAC)85～90%，处理效果具 有较好的优势。
本发明的生产方法中，奶牛养殖废水在培养基里充当碳源和氮源，这样就减少了一般 培养基中50%以上的碳源和氮源，使微生物絮凝剂的成本降低50%～80%。同时利用微生物 絮凝剂进行水处理，操作简便，效果好，无毒，无二次污染，可以在自然条件下降解，且 对人畜无害。
具体实施方式
实施例1、絮凝剂产生菌的分离
将奶牛养殖场所取的活性污泥10g加入1000ml蒸馏水进行稀释，将上述苏稀释后的 活性污泥用特制的NA培养基平板富集培养于30℃恒温培养箱中，培养时间为30小时。 挑选生长旺盛、表面光滑、有点透明的、粘稠的单个菌落，反复划线分离获取单菌落，直 到用镜检确定所得的菌为较纯的单菌落。
上述特制的NA培养基平板由基础NA培养基和奶牛养殖废水组成，基础NA培养基 的成分组成为：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂20g和H2O 1000ml，在上述每升 的基础NA培养基上添加100ml COD浓度为5000mg/L的奶牛养殖废水，并调节 pH=7.4～7.6(例如可用1mol/L的NaOH进行调节)。
对所得的上述较纯的单菌落进行发酵培养，温度为30℃，摇床转速为220r/min，培 养48h;得发酵液。所用的发酵培养基为：稀释后的奶牛养殖废水1L(即，将奶牛养殖废 水经水1∶1的体积比稀释，COD：4880mg/L)，葡萄糖3g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸铵0.5g， 硫酸镁0.2g，氯化钠0.05g，用1mol/L的NaOH调节pH=7～8。
利用高岭土悬浊液和奶牛养殖废水对所筛菌株的絮凝效果实验进行复筛，具体如下：
1)、利用高岭土悬浊液的复筛：在100ml量筒中加入80ml蒸馏水，0.4g高岭土， 5ml 1%(质量浓度)的CaCl2溶液，2ml发酵液，再加蒸馏水至100ml，调节pH值至 7.0，然后倒入150ml烧杯中，放在磁力搅拌器上快速搅拌1min，慢速搅拌5min，静置 10min。
空白对照为将“2ml发酵液”改为“2ml发酵培养基”。
结果观察到有4株菌株使高岭土悬浊液分层，包括ZJ28#，初步判定这4株菌株有絮 凝功能。
2)、利用奶牛养殖废水的复筛：在100ml量筒中加入10ml奶牛养殖废水，5ml 1% 的CaCl2溶液，2ml发酵液，再加蒸馏水至100ml，调节pH值至7.0，然后倒入150ml 烧杯中，放在磁力搅拌器上快速搅拌1min，慢速搅拌5min，静置10min。
空白对照为将“2ml发酵液”改为“2ml发酵培养基”。
结果观察到只有ZJ28#使奶牛养殖废水分层，故确定该菌株为絮凝剂产生菌。
该菌株利用染色观察、生理生化鉴定以及核酸序列(如序列表所述)分析，最后确定 该菌株为解淀粉芽孢杆菌。
将所获取絮凝活性最高的菌株进行保藏，保藏名称为：解淀粉芽孢杆菌ZJ28# Bacillus amyloliquefaciens ZJ28#，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国 武 汉 武汉大学;保藏日期：2011年11月24日，保藏号：CCTCC No：M2011419。
实施例2、一种微生物絮凝剂的生产方法
1)、种子液培养：将分离到的解淀粉芽孢杆菌ZJ28#Bacillus amyloliquefaciens ZJ28# CCTCC No：M2011419取一环接种于装有100ml特制液体培养基的250ml三角瓶中，于 30℃以200r/min转速振荡培养30h，得菌株种子液。
上述所用的特制液体培养基是由基础液体培养基和奶牛养殖废水组成，基础液体培养 基的成分组成为：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g和H2O1000ml，在上述每L基础液体 培养基上添加100ml COD浓度为7000～8000mg/L的奶牛养殖废水，并用1mol/L的NaOH 调节pH=7.4～7.6，得特制液体培养基。
2)、菌株种子液以2.0∶100的体积比接种到发酵培养基中，初始pH值为7.3(为自 然pH值)，温度为30℃，摇床转速为220r/min，培养48h，获得发酵液。
上述所用的发酵培养基的制备方法为：
取奶牛养殖废水与水按照1∶1的体积比稀释，得稀释后的奶牛养殖废水;经检测， 该稀释后的奶牛养殖废水的COD∶4880mg/L。在每升稀释后的奶牛养殖废水中加入葡萄 糖3g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸铵0.5g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.05g，用1mol/L的NaOH 调节pH=7～8。
3)、将发酵液于10000～12000r/min离心15min，取其上清液即为微生物絮凝剂。所 微生物絮凝剂使高岭土的絮凝率可达87%左右。
实验1、微生物絮凝剂的使用方法
将得到的微生物絮凝剂(实施例2所得)与奶牛养殖废水按1∶40的体积比相混合， 充分混匀30min后，经200目筛进行过滤，去除滤渣。
所得的处理水的化学需氧量(COD)由6280mg/L降至890mg/L，生物需氧量(BOD) 由4150mg/L降至794mg/L，悬浮物(SS)由2730mg/L降至332mg/L。
对比实验1：将无机絮凝剂聚合氯化铝与奶牛养殖废水1∶40的体积比相混合，充分 混匀30min后，经200目筛进行过滤，去除滤渣。
所得的处理水的化学需氧量(COD)由6280mg/L降至255mg/L，生物需氧量(BOD) 由4150mg/L降至184mg/L，悬浮物(SS)由2730mg/L降至76mg/L。
上述数据均为养殖废水的检测数据。
结果可见，微生物絮凝剂对COD、BOD和SS的去除效果分别达到了无机絮凝剂的 85.8%、84.6%、90.4%。
实验2：将得到的微生物絮凝剂(实施例2所得)与奶牛养殖废水按1∶50的体积比 相混合，充分混匀40min后，经250目筛进行过滤，去除滤渣。
所得的处理水的化学需氧量(COD)由6530mg/L降至932mg/L，生物需氧量(BOD) 由4530mg/L降至812mg/L，悬浮物(SS)由2810mg/L降至364mg/L。
对比实验2：将无机絮凝剂聚合氯化铝与奶牛养殖废水1∶50的体积比相混合，充分 混匀40min后，经200目筛进行过滤，去除滤渣。
所得的处理水的化学需氧量(COD)由6530mg/L降至325mg/L，生物需氧量(BOD) 由4530mg/L降至207mg/L，悬浮物(SS)由2810mg/L降至87mg/L。
上述数据均为养殖废水的检测数据。
结果可见，微生物絮凝剂对COD、BOD和SS的去除效果分别达到了无机絮凝剂的 89.6%、86.0%、89.8%。
实验3、将得到的微生物絮凝剂(实施例2所得)与奶牛养殖废水按1∶60的体积比 相混合，充分混匀45min后，经300目筛进行过滤，去除滤渣。
所得的处理水的化学需氧量(COD)由6880mg/L降至945mg/L，生物需氧量(BOD) 由4750mg/L降至832mg/L，悬浮物(SS)由2940mg/L降至389mg/L。
对比实验3：将无机絮凝剂聚合氯化铝与奶牛养殖废水1∶60的体积比相混合，充分 混匀45min后，经300目筛进行过滤，去除滤渣。
所得的处理水的化学需氧量(COD)由6880mg/L降至335mg/L，生物需氧量(BOD) 由4750mg/L降至224mg/L，悬浮物(SS)由2940mg/L降至95mg/L。
上述数据均为养殖废水的检测数据。
结果可见，微生物絮凝剂对COD、BOD和SS的去除效果分别达到了无机絮凝剂的 90.7%、86.6%、89.7%。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明 不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直 接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
