申请日2016.08.09
公开(公告)日2016.10.26
IPC分类号C12N1/20; C02F3/34; C12R1/125; C02F101/16
摘要
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种用于处理含高氨氮污水的复合微生物菌剂及其制备方法和应用。所述复合微生物菌剂包含硝化细菌、亚硝化细菌和枯草芽孢杆菌，硝化细菌活菌数为1.0×108～2×108cfu/mL、亚硝化细菌活菌数为1.0×108～1.5×108cfu/mL、枯草芽孢杆菌活菌数为1.0×108～2.0×108cfu/mL，总活菌数为3.0×108～5.5×108cfu/mL。本发明所述复合微生物菌剂用于高氨氮含量污水的处理，使用简单、成本低廉、效果显著，对污水中氨氮的最高去除率达到98%，COD的去除率达到85%，BOD的去除率达到92%，总硫的去除率达到90%，污水色度去除率达到32%。
权利要求书
1.一种用于处理含高氨氮污水的复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂包含有硝化细菌、亚硝化细菌和枯草芽孢杆菌，总活菌数为3.0×108~5.5×108cfu/mL。
2.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂中：硝化细菌的活菌数为1.0×108~2×108 cfu/mL、亚硝化细菌的活菌数为1.0×108~1.5×108cfu/mL、枯草芽孢杆菌的活菌数为1.0×108~2.0×108 cfu/mL。
3.权利要求1~2任一所述用于处理含高氨氮污水的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)固体斜面培养：将硝化细菌、亚硝化细菌和枯草芽孢杆菌分别接种于硝化固体培养基、亚硝化固体培养基和牛肉膏蛋白胨培养基中培养，使菌株充分活化;
(2)一级种子培养：将步骤(1)中活化的硝化细菌、亚硝化细菌及枯草芽孢杆菌分别接种于硝化液体培养基、亚硝化液体培养基和牛肉膏蛋白胨液体培养基中培养，当液体培养菌密度OD600值达到0.6~0.8时停止培养，分别获得一级种子液;
(3)二级种子培养：将步骤(2)所得硝化细菌、亚硝化细菌及枯草芽孢杆菌的一级种子液分别接种于硝化液体培养基、亚硝化液体培养基和牛肉膏蛋白胨液体培养基中培养，分别获得二级种子液;
(4)将步骤(3)中所得硝化细菌、亚硝化细菌及枯草芽孢杆菌的的二级种子液分别接种于硝化发酵培养基、亚硝化发酵培养基和枯草芽孢杆菌发酵培养基中，进行高密度发酵培养，得到菌剂 A、B、C;其中，菌剂 A 为硝化细菌菌剂，菌剂 B 为亚硝化细菌菌剂，菌剂 C为枯草芽孢杆菌菌剂;
(5)将菌剂 A、菌剂 B、菌剂 C混合，即得复合微生物菌剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述菌剂 A、菌剂 B、菌剂 C 的体积比为1~3:1~3:1~3。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述硝化发酵培养基为：硝酸钾0.8~1wt %、硫酸铵0.5~0.7wt %，磷酸二氢钾0.05~0.15wt %，硫酸镁0.05~0.15wt%，余量为水，pH为7.0~7.2;所述亚硝化发酵培养基为：亚硝酸钠0.8~1wt%、硫酸铵0.5~0.7wt%，磷酸二氢钾0.05~0.15wt%，硫酸镁0.05~0.15wt%，余量为水，pH为7.0~7.2;所述枯草芽孢杆菌发酵培养基为：糖蜜4~6 wt%、玉米粉0.35~0.55wt%、硫酸铵0.5~0.7wt%，磷酸二氢钾0.05~0.07wt%，硫酸镁0.05~0.07wt%，余量为水，pH为7.0~7.2。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述发酵培养的条件为：硝化细菌二级种子液以体积比5~15%的接种量接种于硝化发酵培养基中，于28~30℃，110~150rpm，通气量1.0~1.5vvm下进行高密度发酵培养4~6d;亚硝化细菌二级种子液以体积比5~15%的接种量接种于亚硝化发酵培养基中，于28~30℃，160~200 rpm，通气量1.0~1.5vvm下进行高密度发酵培养4~6d;枯草芽孢杆菌二级种子液以体积比5~15%的接种量接种于枯草芽孢杆菌发酵培养基中，于28~30℃，160~200 rpm，通气量1.0~1.5vvm下进行高密度发酵培养4~6d。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述硝化固体培养基为：硝酸钾0.8wt%、硫酸铵0.5wt%，磷酸二氢钾0.05wt%，硫酸镁0.05wt%，琼脂2wt%，余量为水，pH为7.0~7.2;所述亚硝化固体培养基为：亚硝酸钠0.8wt%、硫酸铵0.5wt%，磷酸二氢钾0.05wt%，硫酸镁0.05wt%，琼脂2wt%，余量为水，pH为7.0~7.2;所述牛肉膏蛋白胨固体培养基为：牛肉膏0.5wt%，蛋白胨1wt%，氯化钠0.5wt%，琼脂2wt%，余量为水，pH为7.0~7.2。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中，所述硝化液体培养基为：硝酸钾0.8wt %、硫酸铵0.5wt %，磷酸二氢钾0.05wt %，硫酸镁0.05wt %，余量为水，pH为7.0~7.2;所述亚硝化液体培养基为：亚硝酸钠0.8wt %、硫酸铵0.5wt %，磷酸二氢钾0.05wt %，硫酸镁0.05wt %，余量为水，pH为7.0~7.2;所述牛肉膏蛋白胨液体培养基为牛肉膏0.5wt%，蛋白胨1wt %，氯化钠0.5wt %，余量为水，pH为7.0~7.2。
9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述培养的培养条件为：28~30℃下培养4~6天;步骤(2)和步骤(3)中所述培养的培养条件为：28~30℃，160~180rpm下培养4~6天。
10.权利要求1~2任一所述复合微生物菌剂在含高氨氮污水处理中的应用，其特征在于，所述应用为：将所述复合微生物菌剂加入到污水处理厂高氨氮含量污水处理系统的曝气池中，所述复合微生物菌剂的加入量为污水体积的0.01%。
说明书
一种用于处理含高氨氮污水的复合微生物菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及了一种用于处理含高氨氮污水的的复合微生物菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
水体富营养化问题已经成为人们日益关注的问题，国家对污水的排放标准进行严格的规定和要求。氨氮作为水体的一项重要指标，对其的处理一直受到广泛关注。与COD相似，氨氮也是水体的主要耗氧污染物，氨氮在氧化分解中要消耗水体中的溶解氧，从而使水体发黑发臭。氨氮中的非离子态氨对水生生物具有很强的毒害，有研究表明其危害要比铵盐大几十倍。同时氨氮也为水体中的藻类物质提供丰富的营养，使水体产生富营养化。
目前，去除污水中氨氮的主要方法有物化法，包含离子交换法和吹脱法、混凝法、吸附法、电解法等，主要是通过物理吸附、化学沉底及化学氧化法，将废液中的有害物进行吸附、氧化，从而达到去除污染的目的。我国单纯利用物化法处理污水的具体案例较少，主要是成本太高，劳动强度大，产生二次污染，具有一定的局限性。生物脱氮是以从自然界中分离的氨氮降解微生物为基础，通过微生物的代谢达到对氨氮的分解，具有无污染、经济、高效等特点，是当前被认为的最有效的除氨氮方法，对其的研究也备受重视。现几年来兴起的活性污泥法，在污水处理中得到了广泛应用，但活性污泥法运营成本高，对COD(化学需氧量，Chemical Oxygen Demand)及氨氮的去除率也不够理想。
近几年来，微生物制剂在环境领域得到了广泛应用，但也存在许多问题，比如微生物菌种比较单一，只能针对特定的污染物进行降解，不能有效的改善水体的物质循环，处理效果不理想。实践证明，复合菌剂的效果远好于单一菌种的效果。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的不足，目的在于提供一种用于处理含高氨氮污水的复合微生物菌剂及其制备方法和应用。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：
一种用于处理含高氨氮污水的复合微生物菌剂，包括硝化细菌、亚硝化细菌和枯草芽孢杆菌。
上述方案中，所述复合微生物菌剂的总活菌数为3.0×108～5.5×108cfu/mL。满足该条件的复合微生物菌剂能够更好的对污水中的氨氮等物质进行分解。
上述方案中，所述复合微生物菌剂中：硝化细菌的活菌数为1.0×108～2×108cfu/mL、亚硝化细菌的活菌数为1.0×108～1.5×108cfu/mL、枯草芽孢杆菌的活菌数为1.0×108～2.0×108cfu/mL。
上述方案中，所述硝化细菌为维氏硝化杆菌ATCC 25391，购买自美国模式培养物集存库，所述亚硝化细菌为亚硝化单胞菌ATCC BAA-1201，购买自美国模式培养物集存库，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌ACCC 10157，购买自广东微生物菌种保藏中心。
上述用于处理含高氨氮污水的复合微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)固体斜面培养：将硝化细菌、亚硝化细菌和枯草芽孢杆菌分别接种于硝化固体培养基、亚硝化固体培养基和牛肉膏蛋白胨培养基中培养，使菌株充分活化;
(2)一级种子培养：将步骤(1)中活化的硝化细菌、亚硝化细菌及枯草芽孢杆菌分别接种于硝化液体培养基、亚硝化液体培养基和牛肉膏蛋白胨液体培养基中培养，当液体培养菌密度OD600值达到0.6～0.8时停止培养，分别获得一级种子液;
(3)二级种子培养：将步骤(2)所得硝化细菌、亚硝化细菌及枯草芽孢杆菌的一级种子液分别接种于硝化液体培养基、亚硝化液体培养基和牛肉膏蛋白胨液体培养基中培养，分别获得二级种子液;
(4)将步骤(3)中所得硝化细菌、亚硝化细菌及枯草芽孢杆菌的的二级种子液分别接种于硝化发酵培养基、亚硝化发酵培养基和枯草芽孢杆菌发酵培养基中，进行高密度发酵培养，得到菌剂A、B、C;其中，菌剂A为硝化细菌菌剂，菌剂B为亚硝化细菌菌剂，菌剂C为枯草芽孢杆菌菌剂;
(5)将菌剂A、菌剂B、菌剂C混合，即得复合微生物菌剂。
上述方案中，步骤(1)中，所述硝化固体培养基为：硝酸钾0.8wt%、硫酸铵0.5wt%，磷酸二氢钾0.05wt%，硫酸镁0.05wt%，琼脂2wt%，余量为水，pH为7.0～7.2;所述亚硝化固体培养基为：亚硝酸钠0.8wt%、硫酸铵0.5wt%，磷酸二氢钾0.05wt%，硫酸镁0.05wt%，琼脂2wt%，余量为水，pH为7.0～7.2;所述牛肉膏蛋白胨固体培养基为：牛肉膏0.5wt%，蛋白胨1wt%，氯化钠0.5wt%，琼脂2wt%，余量为水，pH为7.0～7.2。
上述方案中，步骤(2)和步骤(3)中，所述硝化液体培养基为：硝酸钾0.8wt%、硫酸铵0.5wt%，磷酸二氢钾0.05wt%，硫酸镁0.05wt%，余量为水，pH为7.0～7.2;所述亚硝化液体培养基为：亚硝酸钠0.8wt%、硫酸铵0.5wt%，磷酸二氢钾0.05wt%，硫酸镁0.05wt%，余量为水，pH为7.0～7.2;所述牛肉膏蛋白胨液体培养基为牛肉膏0.5wt%，蛋白胨1wt%，氯化钠0.5wt%，余量为水，pH为7.0～7.2。
上述方案中，步骤(4)中，所述硝化发酵培养基为：硝酸钾0.8～1wt%、硫酸铵0.5～0.7wt%，磷酸二氢钾0.05～0.15wt%，硫酸镁0.05～0.15wt%，余量为水，pH为7.0～7.2;所述亚硝化发酵培养基为：亚硝酸钠0.8～1wt%、硫酸铵0.5～0.7wt%，磷酸二氢钾0.05～0.15wt%，硫酸镁0.05～0.15wt%，余量为水，pH为7.0～7.2;所述枯草芽孢杆菌发酵培养基为：糖蜜4～6wt%、玉米粉0.35～0.55wt%、硫酸铵0.5～0.7wt%，磷酸二氢钾0.05～0.07wt%，硫酸镁0.05～0.07wt%，余量为水，pH为7.0～7.2。
上述方案中，步骤(1)中所述培养的培养条件为：28～30℃下培养4～6天;步骤(2)和步骤(3)中所述培养的培养条件为：28～30℃，160～180rpm下培养4～6天。
上述方案中，步骤(4)所述发酵培养的条件为：硝化细菌二级种子液以5～15%(体积比)的接种量接种于硝化发酵培养基中，于28～30℃，110～150rpm，通气量1.0～1.5vvm下进行高密度发酵培养4～6d;亚硝化细菌二级种子液以5～15%(体积比)的接种量接种于亚硝化发酵培养基中，于28～30℃，160～200rpm，通气量1.0～1.5vvm下进行高密度发酵培养4～6d;枯草芽孢杆菌二级种子液以5～15%(体积比)的接种量接种于枯草芽孢杆菌发酵培养基中，于28～30℃，160～200rpm，通气量1.0～1.5vvm下进行高密度发酵培养4～6d。按照上述接种量接种以上种子液进行发酵，能够保证各菌种发酵后的数量以及菌株产生的次级代谢产物的量。
上述方案中，所述菌剂A、菌剂B、菌剂C的体积比为1～3:1～3:1～3。菌剂A、B、C在该体积比例下混合，能够使复合微生物菌剂具有更好的菌种数量组成从而达到最佳的处理废水氨氮的效果。
上述复合微生物菌剂在含高氨氮污水处理中的应用。具体地，所述应用为：将所述复合微生物菌剂以0.01%(与污水的体积比)的比例加入到某污水处理厂高氨氮含量污水处理系统的曝气池中。
本发明的有益效果：本发明所述复合微生物菌剂对含高氨氮污水具有氨氮降解专一性好、降解率高的优点，同时，所述复合微生物菌剂还能产生多种酶和抗菌肽，能迅速分解含高氨氮污水中的有机物等物质，有效抑制产臭微生物的生长，减少臭味的产生，为氨氮降解提供更好的条件，并极大改善了污水的环境;此外，本发明所述复合微生物菌剂可以有效去除污水中的悬浮物质，提高色度去除率，特别地，对畜禽养殖废水的色度有非常好的去处效果，可有效改善出水品质;本发明所述复合微生物菌剂专门地用于高氨氮含量污水的处理，使用简单、成本低廉、效果显著，对污水中氨氮的最高去除率达到98%，COD的去除率达到85%，BOD的去除率达到92%，总硫的去除率达到90%，污水色度去除率达到32%。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
以下实施例中，所述硝化细菌为维氏硝化杆菌ATCC 25391，购买自美国模式培养物集存库，所述亚硝化细菌为亚硝化单胞菌ATCC BAA-1201，购买自美国模式培养物集存库，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌ACCC10157，购买自广东微生物菌种保藏中心。
实施例1
一种用于处理含高氨氮污水的复合微生物菌剂，通过如下方法制备得到：
(1)固体斜面培养：将硝化细菌、亚硝化细菌和枯草芽孢杆菌分别接种于硝化固体培养基、亚硝化固体培养基和牛肉膏蛋白胨培养基中，于28℃恒温培养4天，使菌株充分活化;所述硝化固体培养基为：硝酸钾0.8wt%、硫酸铵0.5wt%，磷酸二氢钾0.05wt%，硫酸镁0.05wt%，琼脂2wt%，余量为水，pH为7.0～7.2;所述亚硝化固体培养基为：亚硝酸钠0.8wt%、硫酸铵0.5wt%，磷酸二氢钾0.05wt%，硫酸镁0.05wt%，琼脂2wt%，余量为水，pH为7.0～7.2;所述牛肉膏蛋白胨固体培养基为：牛肉膏0.5wt%，蛋白胨1wt%，氯化钠0.5wt%，琼脂2wt%，余量为水，pH为7.0～7.2。
(2)一级种子培养：将步骤(1)中活化的硝化细菌、亚硝化细菌及枯草芽孢杆菌分别接种于硝化液体培养基、亚硝化液体培养基和牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于28℃，160rpm下培养4天，当液体培养菌密度OD600值达到0.6时停止培养，分别获得一级种子液;所述硝化液体培养基为：硝酸钾0.8wt%、硫酸铵0.5wt%，磷酸二氢钾0.05wt%，硫酸镁0.05wt%，余量为水，pH为7.0～7.2;所述亚硝化液体培养基为：亚硝酸钠0.8wt%、硫酸铵0.5wt%，磷酸二氢钾0.05wt%，硫酸镁0.05wt%，余量为水，pH为7.0～7.2;所述牛肉膏蛋白胨液体培养基为牛肉膏0.5wt%，蛋白胨1wt%，氯化钠0.5wt%，余量为水，pH为7.0～7.2。
(3)二级种子培养：将步骤(2)所得硝化细菌、亚硝化细菌及枯草芽孢杆菌的一级种子液分别接种于硝化液体培养基、亚硝化液体培养基和牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于28℃，160rpm下培养4天，分别获得二级种子液;其中，硝化液体培养基、亚硝化液体培养基和牛肉膏蛋白胨液体培养基同步骤(2)。
(4)将步骤(3)中所得硝化细菌二级种子液以5%(体积比)的接种量接种于硝化发酵培养基中，于28℃，110rpm，通气量1.0vvm下进行高密度发酵培养4d，获得菌剂A;所述硝化发酵培养基为：硝酸钾0.8wt%、硫酸铵0.5wt%，磷酸二氢钾0.05wt%，硫酸镁0.05wt%，余量为水，pH为7.0。
(5)将步骤(3)中所得亚硝化细菌二级种子液以5%(体积比)的接种量接种于亚硝化发酵培养基中，于28℃，160rpm，通气量1.0vvm下进行高密度发酵培养4d，获得菌剂B;所述亚硝化发酵培养基为：亚硝酸钠0.8wt%、硫酸铵0.5wt%，磷酸二氢钾0.05wt%，硫酸镁0.05wt%，余量为水，pH为7.0。
(6)将步骤(3)中所得枯草芽孢杆菌的二级种子液以5%(体积比)的接种量接种于枯草芽孢杆菌发酵培养基中，于28℃，180rpm，通气量1.0vvm下进行高密度发酵培养4d，获得菌剂C;所述枯草芽孢杆菌发酵培养基为：糖蜜4wt%、玉米粉0.35wt%、硫酸铵0.5wt%，磷酸二氢钾0.05wt%，硫酸镁0.05wt%，余量为水，pH为7.0。
(7)将菌剂A、菌剂B、菌剂C按照体积比为1:1:1混合，即得复合微生物菌剂。
本发明所得复合微生物菌剂，包括：硝化细菌，活菌数为1.0×108cfu/mL;亚硝化细菌，活菌数为1.0×108cfu/mL;枯草芽孢杆菌，活菌数为1.0×108cfu/mL，总活菌数为3.0×108cfu/mL。
实施例2
一种用于处理含高氨氮污水的复合微生物菌剂，通过如下方法制备得到：
(1)固体斜面培养：将硝化细菌、亚硝化细菌和枯草芽孢杆菌分别接种于硝化固体培养基、亚硝化固体培养基和牛肉膏蛋白胨培养基中，于29℃恒温培养5天，使菌株充分活化;所述硝化固体培养基为：硝酸钾0.8wt%、硫酸铵0.5wt%，磷酸二氢钾0.05wt%，硫酸镁0.05wt%，琼脂2wt%，余量为水，pH为7.0～7.2;所述亚硝化固体培养基为：亚硝酸钠0.8wt%、硫酸铵0.5wt%，磷酸二氢钾0.05wt%，硫酸镁0.05wt%，琼脂2wt%，余量为水，pH为7.0～7.2;所述牛肉膏蛋白胨固体培养基为：牛肉膏0.5wt%，蛋白胨1wt%，氯化钠0.5wt%，琼脂2wt%，余量为水，pH为7.0～7.2。
(2)一级种子培养：将步骤(1)中活化的硝化细菌、亚硝化细菌及枯草芽孢杆菌分别接种于硝化液体培养基、亚硝化液体培养基和牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于29℃，170rpm下培养5天，当液体培养菌密度OD600值达到0.7时停止培养，分别获得一级种子液;所述硝化液体培养基为：硝酸钾0.8wt%、硫酸铵0.5wt%，磷酸二氢钾0.05wt%，硫酸镁0.05wt%，余量为水，pH为7.0～7.2;所述亚硝化液体培养基为：亚硝酸钠0.8wt%、硫酸铵0.5wt%，磷酸二氢钾0.05wt%，硫酸镁0.05wt%，余量为水，pH为7.0～7.2;所述牛肉膏蛋白胨液体培养基为牛肉膏0.5wt%，蛋白胨1wt%，氯化钠0.5wt%，余量为水，pH为7.0～7.2。
(3)二级种子培养：将步骤(2)所得硝化细菌、亚硝化细菌及枯草芽孢杆菌的一级种子液分别接种于硝化液体培养基、亚硝化液体培养基和牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于29℃，170rpm下培养5天，分别获得二级种子液;其中，硝化液体培养基、亚硝化液体培养基和牛肉膏蛋白胨液体培养基同步骤(2)。
(4)将步骤(3)中所得硝化细菌二级种子液以10%(体积比)的接种量接种于硝化发酵培养基中，于29℃，130rpm，通气量1.3vvm下进行高密度发酵培养5d，获得菌剂A;所述硝化发酵培养基为：硝酸钾0.9wt%、硫酸铵1.0wt%，磷酸二氢钾0.1wt%，硫酸镁0.1wt%，余量为水，pH为7.1。
(5)将步骤(3)中所得亚硝化细菌二级种子液以10%(体积比)的接种量接种于亚硝化发酵培养基中，于29℃，180rpm，通气量1.3vvm下进行高密度发酵培养5d，获得菌剂B;所述亚硝化发酵培养基为：亚硝酸钠0.9wt%、硫酸铵1.0wt%，磷酸二氢钾0.1wt%，硫酸镁0.1wt%，余量为水，pH为7.1。
(6)将步骤(3)中所得枯草芽孢杆菌的二级种子液以10%(体积比)的接种量接种于枯草芽孢杆菌发酵培养基中，于29℃，190rpm，通气量1.3vvm下进行高密度发酵培养5d，获得菌剂C;所述枯草芽孢杆菌发酵培养基为：糖蜜5wt%、玉米粉0.45wt%、硫酸铵1.0wt%，磷酸二氢钾0.1wt%，硫酸镁0.1wt%，余量为水，pH为7.1。
(7)将菌剂A、菌剂B、菌剂C按照体积比为1:2:3混合，即得复合微生物菌剂。
本发明所得复合微生物菌剂，包括：硝化细菌，活菌数为1.5×108cfu/mL;亚硝化细菌，活菌数为1.25cfu/mL;枯草芽孢杆菌，活菌数为1.5×108cfu/mL，总活菌数为4.25×108cfu/mL。
实施例3
一种用于处理含高氨氮污水的复合微生物菌剂，通过如下方法制备得到：
(1)固体斜面培养：将硝化细菌、亚硝化细菌和枯草芽孢杆菌分别接种于硝化固体培养基、亚硝化固体培养基和牛肉膏蛋白胨培养基中，于30℃恒温培养6天，使菌株充分活化;所述硝化固体培养基为：硝酸钾0.8wt%、硫酸铵0.5wt%，磷酸二氢钾0.05wt%，硫酸镁0.05wt%，琼脂2wt%，余量为水，pH为7.0～7.2;所述亚硝化固体培养基为：亚硝酸钠0.8wt%、硫酸铵0.5wt%，磷酸二氢钾0.05wt%，硫酸镁0.05wt%，琼脂2wt%，余量为水，pH为7.0～7.2;所述牛肉膏蛋白胨固体培养基为：牛肉膏0.5wt%，蛋白胨1wt%，氯化钠0.5wt%，琼脂2wt%，余量为水，pH为7.0～7.2。
(2)一级种子培养：将步骤(1)中活化的硝化细菌、亚硝化细菌及枯草芽孢杆菌分别接种于硝化液体培养基、亚硝化液体培养基和牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于30℃，180rpm下培养6天，当液体培养菌密度OD600值达到0.8时停止培养，分别获得一级种子液;所述硝化液体培养基为：硝酸钾0.8wt%、硫酸铵0.5wt%，磷酸二氢钾0.05wt%，硫酸镁0.05wt%，余量为水，pH为7.0～7.2;所述亚硝化液体培养基为：亚硝酸钠0.8wt%、硫酸铵0.5wt%，磷酸二氢钾0.05wt%，硫酸镁0.05wt%，余量为水，pH为7.0～7.2;所述牛肉膏蛋白胨液体培养基为牛肉膏0.5wt%，蛋白胨1wt%，氯化钠0.5wt%，余量为水，pH为7.0～7.2。
(3)二级种子培养：将步骤(2)所得硝化细菌、亚硝化细菌及枯草芽孢杆菌的一级种子液分别接种于硝化液体培养基、亚硝化液体培养基和牛肉膏蛋白胨液体培养基中，于30℃，180rpm下培养6天，分别获得二级种子液;其中，硝化液体培养基、亚硝化液体培养基和牛肉膏蛋白胨液体培养基同步骤(2)。
(4)将步骤(3)中所得硝化细菌二级种子液以15%(体积比)的接种量接种于硝化发酵培养基中，于30℃，200rpm，通气量1.5vvm下进行高密度发酵培养6d，获得菌剂A;所述硝化发酵培养基为：硝酸钾1.0wt%、硫酸铵1.5wt%，磷酸二氢钾0.15wt%，硫酸镁0.15wt%，余量为水，pH为7.2。
(5)将步骤(3)中所得亚硝化细菌二级种子液以15%(体积比)的接种量接种于亚硝化发酵培养基中，于30℃，200rpm，通气量1.5vvm下进行高密度发酵培养6d，获得菌剂B;所述亚硝化发酵培养基为：亚硝酸钠1.0wt%、硫酸铵1.5wt%，磷酸二氢钾0.15wt%，硫酸镁0.15wt%，余量为水，pH为7.2。
(6)将步骤(3)中所得枯草芽孢杆菌的二级种子液以15%(体积比)的接种量接种于枯草芽孢杆菌发酵培养基中，于30℃，200rpm，通气量1.5vvm下进行高密度发酵培养6d，获得菌剂C;所述枯草芽孢杆菌发酵培养基为：糖蜜6wt%、玉米粉0.55wt%、硫酸铵1.5wt%，磷酸二氢钾0.15wt%，硫酸镁0.15wt%，余量为水，pH为7.2。
(7)将菌剂A、菌剂B、菌剂C按照体积比为1:3:2混合，即得复合微生物菌剂。
本发明所得复合微生物菌剂，包括：硝化细菌，活菌数为2×108cfu/mL;亚硝化细菌，活菌数为1.5×108cfu/mL;枯草芽孢杆菌，活菌数为2.0×108cfu/mL，总活菌数为5.5×108cfu/mL。
