申请日2015.02.06
公开(公告)日2016.10.05
IPC分类号C12N1/20; C12N1/12; C02F3/34; C02F3/32; C12P39/00; C12P7/64; C12R1/89; C12R1/01
摘要
本发明提供了一种提高小球藻在养猪废水中生物量的方法，属于微生物应用领域。本发明将保藏编号为CGMCC NO.9225的小球藻与保藏编号为CGMCC NO.7724的类芽孢杆菌共培养于养猪废水中，结果发现类芽孢杆菌能够显著提高小球藻在养猪废水中的生物量，促进作用达1.6倍。本发明方法解决了养猪废水处理问题，降低环境污染，类芽孢杆菌的加入改善了养猪废水中水体微环境，显著提高小球藻生物量，降低了微藻生物柴油的生产成本，取得较好的经济效益，具有良好的市场应用前景。
权利要求书
1.一种提高小球藻(Chlorella sp.)生物量的方法，其特征在于，在培养小球藻的培养基中添加类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)。
2.一种提高小球藻(Chlorella sp.)在养猪废水中生物量的方法，其特征在于，在培养小球藻的养猪废水中添加类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述小球藻为34-2，其保藏编号为CGMCC NO.9225，所述类芽孢杆菌为18WLY，其保藏编号为CGMCC NO.7724。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述养猪废水为猪场养猪产生的废水稀释3-6倍后得到的废水。
5.如权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于，小球藻的初始接种量为3×108-5×108个/ml养猪废水;类芽孢杆菌的初始接种量为1×10-4-2×10-4g/ml养猪废水。
6.如权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于，接种类芽孢杆菌与小球菌的干重比为15-20:1。
7.如权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于，培养条件为20-35℃，一天中光照与黑暗时间比为14-18:6-10，培养3-8天。
8.权利要求1-7任一所述方法在制备生物油脂中的应用。
9.保藏编号为CGMCC NO.7724的类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)及含有其的菌剂在提高小球藻(Chlorella sp.)生物量中的应用。
10.保藏编号为CGMCC NO.7724的类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)及含有其的菌剂在减少养殖场废水污染中的应用。
说明书
一种提高小球藻在养猪废水中生物量的方法
技术领域
本发明属于微生物利用与生物油脂制备领域，具体地说，涉及一种提高小球藻在养猪废水中生物量的方法。
背景技术
富油微藻产业已经成为的最具前途的生物柴油产业之一，且备受关注。微藻与其他能源作物相比有着多种优势，如低投入高产量，不与农争地，不与农争肥，可利用废气、废水、咸水生长，不需要除草剂、杀虫剂，微藻细胞残渣可用于农用肥料或动物饲料或继续生产沼气或乙醇等。
目前，动物排泄物污染愈加严峻，不仅导致了水体富营养化，对农业生产造成了危害，对人们的生活环境也产生了负面影响。随着环境问题及能源问题的日益严重，微藻培养与污水处理相结合已经成为一种新的趋势。养猪废水(Liquid swine manure,LSM)中含有大量猪排泄物，富含有机碳源以及如氮、磷等其他营养成分，被视为高浓度污水，直接排放会导致水体富营养化，污染水源。此外，养猪废水携带大量的病原菌、散发极浓的臭味，日益对环境造成严重污染。而微藻则有着利用污水中的有机及无机污染物并将其转化为细胞组分(如脂质和碳水化合物)的能力。微藻是生产生物柴油的优质原料。微藻的产油率是油料作物如大豆的30-100倍，为生产替代性燃料油奠定了基础。藻类以光能作为能源，利用氮、磷等营养物质合成复杂的有机质。因此，藻类可降低污水中的氮、磷含量。对污水中氮、磷的去除起到了较好的效果。
然而，藻种的选择至关重要，只有特定的藻种可以在养猪废水中生长。这主要是由于养猪废水中氨氮(NH3-N)浓度过高且含有其他有毒物质，而大部分微藻对其均十分敏感，从而限制了微藻在废水中的生长。之前的研究表明只有一小部分的小球藻Chlorellasp.，栅藻Scenedesmus sp.及绿裸藻Euglena sp.可以被应用于污水处理中。另外，尽管一些藻种可以在养猪废水中生长，但是其生物量低且油脂含量低，相对于生物柴油的获得并不经济。可以说，为了让微藻于污水中产生更多的生物柴油需有两点突破，其一即选择合适的藻种及培养方法增加微藻的生物量，其二则为增加微藻细胞内的含油量。
有研究表明，微藻可以为异养细菌提供所需要的氧及有机物，与此同时异养细菌释放出的二氧化碳及养分(小分子氮、磷)可以供微藻生长利用。
固氮类芽孢杆菌属于自生固氮菌，其是一类可以产生芽孢，抗逆性强，存活时间长，适应性强，分布广泛，能够固氮的微生物。固氮类芽孢杆菌具有固氮作用的同时，还可产生一些促进植物生长的物质及一些抗菌物质，能有效的改善土壤微环境，促进植物生长以及增强植物抗病害的能力，该属中的许多菌株被作为植物根际促生菌而广泛研究，但都仅限于大型植物，目前并没有固氮类芽孢杆菌作为微藻培养中促生菌的例子。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高小球藻在养猪废水中生物量的方法。
本发明首先提供一种提高小球藻(Chlorella sp.)生物量的方法，是在培养小球藻的培养基中添加类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)。
本发明提供一种提高小球藻(Chlorella sp.)在养猪废水中生物量的方法，在培养小球藻的养猪废水中添加类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)。
本发明的上述方法中，所述小球藻为34-2，其保藏编号为CGMCC NO.9225，该菌株已于2014年5月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为小球藻Chlorella sp.。
所述类芽孢杆菌为18WLY，其保藏编号为CGMCC NO.7724，该菌株已于2013年6月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为Paenibacillus sp.。
所述养猪废水为猪场养猪产生的废水经过稀释3-6倍体积后得到的废水。优选地，为稀释5倍后得到的废水。稀释液选自自来水或去离子水。稀释的目的是为小球藻提供更好的水体微环境并使其更充分接受光照进行光合作用。
本发明提供的提高小球藻(Chlorella sp.)在养猪废水中生物量的方法中，小球藻的初始接种量为3×108-5×108个/ml养猪废水;类芽孢杆菌的初始接种量为1×10-4-2×10-4g/ml养猪废水。
优选地，小球藻的初始接种量为4.3×108个/ml养猪废水;类芽孢杆菌的初始接种量为1.26×10-4g/ml养猪废水。
进一步地，本发明方法中，接种类芽孢杆菌与小球菌的干重比为15-20:1。优选地，类芽孢杆菌与小球菌的干重比为18:1。
本发明将类芽孢杆菌与小球菌在养猪废水中共培养的培养条件为20-35℃，一天中光照与黑暗时间比为14-18:6-10，培养3-8天。优选地，28℃培养3天，一天中光照与黑暗的时间比为16:8。光照可选自然光或人工光源，光照强度为5000lux时促生效果明显。
本发明的上述方法可以在制备生物油脂中应用。
本发明还提供了保藏编号为CGMCC NO.7724的类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)及含有其的菌剂在提高小球藻(Chlorella sp.)生物量中的应用。
本发明提供了保藏编号为CGMCC NO.7724的类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)及含有其的菌剂在减少养殖场废水污染中的应用。
类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)18WLY(保藏编号CGMCCNO.7724)为申请人在前期筛选而得的一株固氮菌类芽孢杆菌，具有适应性强，固氮能力强的特点，可以有效促进玉米等农作物的产量提高。申请人意外地发现，将该菌与小球藻Chlorella sp.34-2共培养于养猪废水后，发现Paenibacillus sp.18WLY在短暂抑制Chlorellasp.34-2的生长后对其的生物量起到了显著的促进作用，促进作用高达1.6倍。这种结果及其用途是本领域技术人员在微藻生物质能源领域无法预测到的。
本发明还提供一种生产生物油脂的方法，将小球藻(Chlorellasp.)34-2和类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)18WLY共培养于猪场废水中。
本发明的小球藻Chlorella sp.34-2采自安徽省宣城市，其具有在不灭菌的养猪废水中迅速生长的特点(于养猪废水中培养10天，藻细胞干重的平均增长速率为：165mg·L-1·d-1)，并可将污水中碳源污染物转化成高达30%的生物油脂，且其沉降性好，易于收集。此外，该小球藻对养猪废水中的碳、氮、磷等营养元素去除效率较高，养猪废水经其处理7天后氮、磷去除率分别为60%和85%。再者，该藻环境适应性很强，在20-40℃和pH 3-11范围环境下均可良好生长，具有较大的生产应用潜力。本发明首次将小球藻和类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)共培养于猪场废水，发现类芽孢感觉对小球藻生物量的提高产生了显著促进作用，其稳定期小球藻的生物量达1.80×1010个/ml，为未接种Paenibacillus sp.18WLY瓶中小球藻生物量(1.15×1010个/ml)的1.6倍，促生作用显著。本发明方法解决了养猪废水处理问题，降低环境污染，类芽孢杆菌的加入改善了养猪废水中水体微环境，显著提高小球藻生物量，降低了微藻生物柴油的生产成本，取得较好的经济效益，具有良好的市场应用前景和保护生态的作用。
